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Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto

ABREVIATURAS
ADN – Ácido desoxiribonucleico;
PCR – Reacção em cadeia da polimerase;

TBD – Desmineralizante;

Luz UV – Luz Ultra-violeta;

dNTPs – Nucleotídeos trifosfatados;


K-Ras – gene humano;
Nm – nanómetros;
Ng – nanogramas;
Fig. – Figura.

RESUMO
Introdução: A constituição do dente permite que este resista melhor que qualquer outro tecido humano à degradação postemortem, o que possibilita a sua preservação e a do material genético que está no seu interior. Desta forma, os dentes podem ser usados, quer através de métodos comparativos entre dados antemortem e postmortem, quer por análise de ADN, para a identificação do indivíduo sem identidade confirmada.

Objectivos: Recolher o ADN que se encontra no interior de dentes extraídos do paciente há mais de 5 anos e verificar se o material genético se encontra preservado e se permite reconstituir perfis genéticos para identificação de indivíduos, o que poderá ser importante em casos de exumação de cadáveres com mais de 5 anos sem identificação confirmada.

Métodos: Foram usados 13 dentes de diferentes doentes, extraídos em consultório há mais de 5 anos, sendo deixados em ambiente natural de forma a simular as condições em que um cadáver poderia ser encontrado. Fez-se a descalcificação dos dentes para adquirirem uma consistência de fácil manipulação para serem triturados com o Ultra turrax®.

Fez-se a extracção de ADN das amostras com o kit da Invitek® e foram quantificadas pelo NanoDrop1000®. Foi efectuada uma primeira amplificação, através de um PCR convencional. Numa segunda fase, realizar-se-á um PCR específico para a identificação do indivíduo.



Resultados: Após a extracção e quantificação do ADN das amostras, obtiveram-se resultados positivos em todas, apresentando uma média de 600 a 700 ng de ADN total. Para a amplificação do ADN realizou-se um primeiro PCR convencional contra um gene humano, K-Ras, tendo-se obtido uma amplificação entre 100 a 150pb.

Conclusão: A extracção de ADN a partir de dentes pode-se concretizar, revelando-se bastante útil e os seus resultados apresentam um elevado grau de fiabilidade.

PALAVRAS - CHAVE
Dente; ADN Forense; PCR; Identificação; Perfil Genético.

ABSTRACT
Introduction: The constitution of the teeth allows it to resist better to postmortem degradation than any other human tissue, making possible their preservation and of the genetic material inside. Thus teeth can be used, whether by comparative methods using antemortem and postmortem data, or by DNA analysis, for the identification of a subject with no confirmed identity.

Aims: To collect the DNA in the interior of teeth extracted from the patient over 5 years ago and check if the genetic material is preserved and allows the reconstruction of genetic profiles for subject identification, which may be important in case of the exhumation of corpses older than 5 years with no confirmed identity.

Methods: Thirteen teeth were used, extracted in a dentist’s surgery over 5 years ago, which were left in a natural environment so as to simulate the conditions in which a corpse might be found. The teeth were decalcified, so that they would acquire a consistency allowing for easy manipulation in order to be ground with Ultra turrax®.

The DNA was extracted from the samples using the Invitek® kit and they were quantified by NanoDrop1000®. A first amplification was made using a conventional PCR. In a second stage, a specific PCR was made.



Results: After the extraction and quantification of the DNA of the samples, positive results were obtained from all of them, showing an average of 600 to 700ng of total DNA. For the amplification of the DNA, first a conventional PCR was made against a human gene, K-Ras, and an amplification between 100 and 150pb was obtained.

Conclusion: We can say that the analysis of DNA from teeth can be very useful and the result presents a high degree of reliability.

KEY-WORDS
Teeth; DNA; Forensic; PCR; Identity; Genetic profile.


INTRODUÇÃO
A Medicina Dentária Forense tem assumido um importante papel na identificação do indivíduo. Quando um cadáver surge num avançado estado de decomposição ou de tal forma desfigurado que seja impossível o seu normal reconhecimento através de tatuagens, próteses, sinais, cicatrizes e marcas de fracturas ósseas, impressões digitais ou pertences pessoais, uma das formas é recorrer à Medicina Dentária Forense. (1, 2, 3, 4)

Nos casos de desastres em massa, nomeadamente acidentes aéreos em que há um elevado número de vítimas carbonizadas e em que os dentes são, praticamente, o único elemento identificativo, a Medicina Dentária Forense adquire um papel central no processo de identificação. (2) Nestes casos, os métodos dentários mais comummente utilizados são a identificação comparativa através de registos dentários estabelecidos antemortem (fichas de registo de actividades clínicas, radiografias, próteses, modelos, fotografias extra-oral e intra-oral, entre outros) que são comparados com os achados dentários encontrados ou através da reconstituição de perfis dentários postmortem. (3, 5, 6)

As contribuições da Medicina Dentária Forense no processo da identificação humana são de índole variável. Por exemplo, as diferenças na forma e tamanho dos dentes podem permitir chegar a uma determinação racial e sexual do indivíduo (salienta-se que os factores hereditários que se reflectem nos dentes são outro elemento a ter em conta na identificação do indivíduo); a coloração, as marcas e as alterações no esmalte permitem, muitas vezes, determinar os hábitos culturais e profissionais em vida, enquanto a fase eruptiva em que os dentes se encontram, a rizogénese, a abrasão e o desgaste dentário podem dar uma noção da idade do indivíduo no momento da sua morte. Os tratamentos dentários efectuados ao longo da vida, como restaurações, próteses, extracções, ortodontia, implantes, podem, igualmente, ser elementos de grande valor para a identificação do indivíduo quando se dispõe da ficha dentária para comparação. (2)

Quando se pretende identificar restos esqueletizados, deve-se ter em conta as variáveis que podem afectar a resistência do dente e inviabilizar a sua utilização como método identificativo. Por exemplo, o tipo de solo em que os corpos são encontrados vai ter uma grande influência no estado de conservação do dente. Desta forma, se o terreno possuir um elevado grau de acidez, o dente pode sofrer uma grande destruição devido à actuação desmineralizante dos ácidos que o compõem. Por outro lado, terrenos neutros ou alcalinos podem conservar bastante os dentes, fossilizando-os. Também a idade, a constituição do indivíduo, o grau de humidade, a temperatura ambiente e o meio em que o corpo foi encontrado podem actuar sobre o estado de conservação dos dentes. (2, 3)

Se através dos métodos comparativos não for possível estabelecer um padrão de identidade do indivíduo, pode recorrer-se à identificação através de técnicas de biologia molecular forense, nomeadamente a análise de ADN recolhido de diversas partes do corpo. Quando os tecidos moles corporais estão num estado de decomposição tão avançado que impossibilite a sua recolha, o complexo pulpar pode estar preservado e ser utilizado como fonte de ADN para posterior identificação do indivíduo, dado que os tecidos dentários, pela sua constituição, apresentam uma enorme resistência às variações ambientais, à decomposição, ao trauma, às mutilações, à incineração e à imersão. (1, 3, 7, 8, 9, 10)

Dentro desta temática, vários têm sido os estudos em que a identificação do indivíduo se faz a partir da análise de ADN obtido de dentes. Neles, vêm descritas várias técnicas de extracção, de análise de ADN e de reconstituição do perfil genético. (7, 11, 12) O perfil genético de um indivíduo (também denominado como perfil de ADN) é obtido através da análise do seu material genético. Recorrendo a kits comerciais patenteados e validados, pode-se rapidamente amplificar 16 diferentes regiões altamente polimórficas e obter o perfil único de cada indivíduo. (1, 4, 10, 13, 14)

Após a análise detalhada dos artigos referentes aos estudos supracitados, constatou-se que, em alguns desses trabalhos, a recolha de ADN em dentes ocorreu pouco tempo após a morte do indivíduo, pelo que a polpa ainda se encontrava num bom estado de conservação. (10, 14) Salienta-se ainda que se encontraram algumas referências a pesquisas em que a colheita de ADN se deu passados vários anos após a morte do indivíduo. No entanto, estes trabalhos tiveram por base uma amostra muito reduzida (15, 16) e, por isso, pouco significativa para se tirar conclusões ou então o tempo decorrido entre a morte do indivíduo e a análise do ADN dos dentes não foi superior a 5 anos. (8, 13)

Assim, o presente estudo, baseado numa amostra mais significativa, tem como objectivo extrair e analisar o ADN que se encontra no interior de dentes extraídos há mais de 5 anos e verificar se o material genético se encontra num estado de preservação que permita reconstituir perfis genéticos para identificação de indivíduos, o que poderá ser importante em casos de exumação de cadáveres com mais de 5 anos sem identificação confirmada.



MATERIAL E MÉTODOS
Amostra:
Antes de se iniciar o estudo, o projecto foi remetido à Comissão de Ética da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto, cujo parecer foi a dispensa de autorização, alegando não ser necessário tal procedimento, uma vez que os dentes usados já tinham mais de 5 anos e o trabalho em causa não iria violar a identidade dos indivíduos a quem pertenciam os dentes.

Inicialmente, partiu-se de uma amostragem de 50 dentes que foram extraídos em consultório, há mais de 5 anos, sendo, no entanto, usados apenas 13. Estes dentes foram cedidos anonimamente e os indivíduos dadores foram informados de que a utilização dos mesmos serviria para estudos onde a sua identidade não seria violada.

Os dentes, após a sua extracção, foram lavados com água corrente e armazenados em recipientes que foram deixados em ambiente natural e não estéril com variações de temperatura e humidade, de forma a simular as condições em que um cadáver poderia ser encontrado.
Extracção de ADN
Primeiramente, os dentes foram lavados e colocados numa solução alcoólica desinfectante, durante 24 horas. Com este procedimento pretendeu-se eliminar qualquer tipo de fonte de ADN exógeno da superfície dos dentes que pudesse interferir com todo o processo final.

D


Fig. 1 – Ultra turrax® – Agitador e homogeneizador que serviu para triturar os dentes.
e seguida, fez-se a descalcificação dos dentes com Shandon TBD-1 da Thermo Electro Corporation®, segundo as indicações do fabricante, até que estes adquirissem uma consistência borrachóide de fácil manipulação. Após este passo, os dentes foram triturados com o agitador homogeneizador Ultra turrax®.

Seguidamente, procedeu-se à extracção de ADN de cada uma das misturas obtidas anteriormente, com o auxílio do kit Invitek®, seguindo as instruções do fabricante.




Fig. 2 – Kit Invitek® usado para extrair o DNA das amostras.



Quantificação do ADN
As amostras foram quantificadas pelo NanoDrop1000®, que mediu a quantidade de ADN que cada uma delas possuía através de absorvância de luz UV com um comprimento de onda que varia entre 220 a 750 nm. Também foi possível avaliar a razão de contaminantes, nomeadamente, proteínas e sais, sendo estes dois elementos considerados como possíveis responsáveis por problemas de amplificação. (17, 18)




Fig. 3 – NanoDrop1000® – instrumento usado para quantificar o DNA existente na amostra através da absorvância da luz UV



Amplificação do ADN
De forma a obtermos uma resposta concreta à pergunta: “o ADN extraído será ou não humano?”, foi efectuada uma primeira amplificação para um dado gene humano, K-Ras, através de um PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase) convencional. Numa segunda fase, será realizado um PCR específico com o kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification a fim de se obter os perfis genéticos de cada indivíduo.




Fig.4 – Kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification – kit usado para realizar o PCR específico

A técnica de PCR envolve um conjunto de ciclos com variações de temperatura. Através do aquecimento, até aos 95ºC, as cadeias de ADN são separadas, formando duas cadeias simples; em seguida, diminui-se a temperatura, aproximadamente para os 55ºC, para que os primers, oligonucleótidos iniciadores, se unam às cadeias simples de ADN por complementaridade de bases. Posteriormente, a temperatura é novamente elevada para os 70ºC, temperatura óptima para que a enzima Taq ADN pol, na presença de outros factores e dos dNTPs (nucleotídeos trifosfatados), se ligue na região dos primers e promova a polimerização, copiando a cadeia molde. Este ciclo é repetido dezenas de vezes, permitindo amplificar em milhares de cópias a sequência de ADN desejado, com uma elevada sensibilidade e especificidade, sendo, deste modo, possível a reconstrução do perfil genético do indivíduo. (1, 8, 11, 13)



RESULTADOS

Dos 50 dentes recolhidos, iniciou-se o estudo com uma série de 13 dentes, escolhidos aleatoriamente e utilizando todos os tecido de origem dentária.






Fig.5 – Amostras colocadas em desmineralizante (TBD-1) para adquirirem uma consistência mole para serem trituradas

Fig.6 – Vista em pormenor do aspecto dos dentes mergulhados no desmineralizante (TBD-1)

Para verificar a quantidade e a qualidade do ADN das amostras, procedeu-se à sua extracção, conforme o referido, com o kit da Invitek® , e à sua quantificação através do NanoDrop®. Os resultados podem ser considerados positivos em todas as amostras testadas, tendo-se obtido, em média, 600 a 700 ng de ADN total.


Para a amplificação do ADN recorreu-se à técnica de PCR, tendo-se realizado um primeiro PCR convencional contra um gene humano, K-Ras, com sucesso e um segundo PCR específico será realizado com kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification.


Fig. 7 – Preparação das amostras para o PCR – aplicação do primer





Fig. 8 – Colocação das amostras no termociclador para se realizar um PCR convencional.



Fig. 9 – Ciclo do PCR convencional.

No ensaio realizado para o PCR convencional, obteve-se uma resposta positiva, tendo ocorrido uma amplificação entre 100 a 150 pb. Apenas em 2 dos 13 casos não houve amplificação, provavelmente, devido à presença de agentes inibidores ou devido à possível fragmentação do ADN.






Fig. 10 – Resultado do PCR convencional de 3 dos 13 casos - Este resultado mostra que ocorreu a amplificação do ADN das amostras obtendo-se um peso molecular de cerca de 150pb contra o gene humano K-Ras.

DISCUSSÃO
O dente, pela sua constituição, protege o tecido pulpar contra diversas agressões do meio. Em casos extremos, em que corpos carbonizados são encontrados em acidentes, cenas de crimes ou quando as ossadas são o único material que pode ser aproveitado para identificar a vítima, os únicos materiais a serem colectados pelos peritos são os dentes e os ossos, uma vez que os normais meios de identificação do indivíduo, tais como análise de impressões digitais, pertences pessoais, sinais ou mesmo tatuagens, não podem ser aplicados. (1, 2, 3, 4)

A identificação do indivíduo a partir dos dentes baseia-se, principalmente, na comparação de registos estabelecidos antemortem com dados recolhidos postmortem e requer a existência de elementos que possibilitem uma comparação, tal como fichas de registos dentários, radiografias dentárias e cranianas, modelos de gesso das arcadas dentárias, fotografias extra e intra-oral, entre outros, realizados em vida. (2, 6)

Quando não é possível reunir informação dos registos dentários do indivíduo em vida que permita estabelecer uma comparação com os restos mortais encontrados ou se estes não permitem construir um perfil dentário postmortem, podemos recorrer à análise do material genético que se encontra no interior dos dentes. (2, 3, 5)

Vários estudos(7,10,13,18) demonstraram que os dentes humanos, em condições ambientais favoráveis, puderam ser usados como fonte de ADN para identificação de indivíduos, quando o seu normal reconhecimento não foi possível.

No estudo realizado por Malaver & Yunis (2003) (13), foram avaliados diferentes tecidos de origem dentária como fonte de material genético para análise forense. Usaram uma amostra de 20 dentes humanos obtidos de corpos não identificados, inumados em 1995 e exumados em 2000, tendo obtido 45 amostras de ADN (5 de polpa, 20 de dentina e 20 de cemento). A polpa foi o tecido que produziu maior sinal de amplificação através da técnica de PCR, enquanto a dentina e o cemento produziram sinais mais fracos, mas semelhantes entre si. Assim, ficou demonstrado que os dentes e os tecidos que os compõem podem ser usados como fonte de ADN, podendo ser usado na identificação humana.

Gaytmenn & Sweet (2003)(19) realizaram um estudo em que fizeram a comparação quantitativa de ADN proveniente de diferentes regiões de dentes humanos: cúspides da coroa, corpo da coroa, corpo radicular e ápice radicular. Os resultados obtidos revelaram que as cúspides da coroa não forneceram uma quantidade mínima de material genético necessário para a realização de um PCR. Por outro lado, o corpo radicular foi a região que forneceu maior quantidade de material genético.

No presente estudo, foram usados dentes extraídos, em consultório, há mais de 5 anos e que ficaram sujeitos às condições ambientais do meio, de forma a simular possíveis condições que se poderiam encontrar num caso forense real.

Para se ter acesso ao ADN que se encontra no interior dos dentes, foi usada uma solução desmineralizante (20, 21), de forma a que os tecidos duros do dente adquirissem uma consistência mole que facilitasse a sua trituração. Este procedimento também foi realizado nos estudos de Kovatsi L, et al. (2009), bem como nos de Malaver PC. e Yunis JJ. (2003), nos de Ginther C., Issel-Tarver L. e King MC. (1992) e nos de Rohland N. e Hofreiter M. (2007) (12,13,14, 18).

Quando se procedeu à extracção e quantificação do ADN, obtiveram-se razoáveis quantidades de material genético. Estes resultados são coerentes com os obtidos nos estudos de Tran-Hung L., Tran-Thi N., Aboudharam G., Raoult D., Drancourt M. (2007), Ginther C., Issel-Tarver L. e King MC. (1992) e Gaytmenn R, Sweet D. (2003) (10, 14, 19), Estes dados permitem considerar que os tecidos dentários são uma boa fonte de material genético; graças à sua excelente constituição (esmalte, dentina e cemento), os dentes protegem o ADN. Este facto, juntamente com condições favoráveis do local onde se encontram, pode levar à mumificação dos tecidos pulpares e, consequentemente, à preservação do material genético, podendo ser extraído e aplicado na identificação do indivíduo. Idênticas conclusões foram retiradas nas investigações conduzidas por Pretty IA. e Sweet D. (2001), Minaguchi K, et al. (2005) e Gaytmenn R, Sweet D. (2003)(2, 3, 5, 19)

A técnica de PCR foi usada para amplificar o ADN das amostras e verificar se existia ADN com qualidade e integridade suficientes para se conseguir construir o perfil genético dos indivíduos. Esta mesma técnica foi igualmente escolhida pela maioria dos autores (1,3,4,5,8,9,10,12,13,14,15,16,18,19), facto que motivou a nossa escolha.

No ensaio realizado para o PCR convencional contra um gene humano, K-Ras, conseguiu-se obter a amplificação do ADN das amostras, com excepção de duas, em que não obtivemos resultados positivos, tendo-se obtido nas restantes uma amplificação com um peso molecular de 100 a 150pb.

Os resultados obtidos no PCR convencional, no caso das duas amostras em que não se obteve amplificação, podem ter-se ficado a dever a vários factores, que influenciaram todo o processo, actuando num ou em mais pontos da reacção, tais como: interferência na lise celular necessária para o processo de extracção do ADN; interferência com a degradação ou captura dos ácidos nucleicos; inibição da actividade da polimerase para amplificação da sequência-alvo; presença de elevado grau de degradação do ADN das amostras; fragmentação do ADN; existência de substâncias inibidoras extraídas juntamente com o ADN das amostras, como é o caso de sais, proteínas, lípidos, polissacarídeos e outros compostos oligoméricos com grupos fenol livres que vão levar à inibição da amplificação directa por PCR. (17, 22)

No PCR específico, a realizar, ter-se-á de ter em consideração este e outros aspectos que possam levar a um resultado final menos positivo.

CONCLUSÃO
Assim, com base nos resultados obtidos, podemos afirmar que existe ADN humano nas amostras, num bom estado de conservação, com qualidade e que se encontra capaz de ser amplificado, apresentando um peso molecular de 150pb.

No segundo ensaio, realizar-se-á um PCR específico com o kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification.


Era, ainda, objectivo deste estudo a realização de perfis genéticos a partir do ADN retirado dos dentes usados como amostras. Não foi possível realizar esta etapa do estudo, dado que os custos com este kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification são elevados, sendo necessários mais tempo e recursos económicos do que aqueles que se disponibilizavam a fim de se obter um resultado positivo.

Caso o PCR específico com o kit AmpFℓSTR® Profiler Plus® PCR Amplification não funcionasse, poder-se-ia purificar, de novo, o ADN de modo a reduzir a quantidade de contaminantes que possam inibir o PCR, tais como proteínas e sais. Outro factor que poderia, também, intervir negativamente é a possível degradação do próprio ADN. Se este facto se verificasse, teríamos de recorrer à utilização de um novo kit para PCR específico, que surgiu recentemente no mercado, com zonas mais pequenas e mais específicas para amplificação, evitando zonas de ADN degradado que podem dar origem a resultados pouco conclusivos.

Como, no entanto, foi possível obter a amplificação de ADN humano a partir dos tecidos de origem dentária, usados como amostra, através de um PCR convencional, podemos afirmar que dentes extraídos há mais de 5 anos podem ser usados para estabelecer um padrão de identificação do indivíduo, a partir do material genético que se encontra na sua constituição.

Tem-se como objectivo dar continuidade a este estudo e submeter uma nova amostra de dentes extraídos há vários anos a diferentes variáveis, de forma a simular possíveis condições em que os cadáveres se podem encontrar. Para isso, a amostra deverá ser submetida à acção de diferentes temperaturas, graus de humidade e pH, à imersão, a diferentes tipos de solos e à acção dos seres que o habitam, durante um determinado período de tempo, para se verificar se existe alguma influência destes factores e qual ou quais são os mais significativos sobre o material genético que se encontra nos dentes e se, após a acção destes factores, o ADN que está presente no seu interior é viável para ser utilizado na identificação do indivíduo sem identidade confirmada.

Assim, considerando-se os dentes como fontes viáveis para a obtenção de material genético para análise de perfis de ADN, mesmo tratando-se de amostras arqueológicas (13), a presença do profissional de Medicina Dentária nas instituições de Medicina Legal é cada vez mais útil e importante, na medida em que este tipo de amostra biológica começa a ser usada com mais frequência nos serviços médico-legais, sendo o Médico Dentista o profissional com mais experiência para lidar com tais elementos. (2,3, 23)


AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à Professora Doutora Inês Caldas, Mestre Luís Cirnes e ao IPATIMUP pelo apoio e colaboração no desenvolvimento deste projecto.

BIBILOGRAFIA
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Lígia Isabel Ferreira Viegas 2009/2010


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