Anticorpo anti-endomísio



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INSTRUÇÕES DE USO


HEMAGEN®VIRGO


ANTI-ENDOMISIAL IgA (EmA) - Imunofluorescência

Cat. No. 904180 - 48 testes



USO DO PRODUTO
Este kit é usado para a detecção dos anticorpos Anti-Endomísio IgA (EmA) em um sistema de teste de imunofluorescência no soro humano.
RESUMO, EXPLICAÇÃO E PRINCÍPIO DO TESTE
O ensaio de imunofluorescência (IFA) para os anticorpos anti-endomísio tem sido um bom método para a pesquisa de doenças do celíaco. As subclasses do IgA (EmA IgA) dos anticorpos antiendomísio reagem com o componente do retículo do endomísio do músculo liso em tecido do esofago de primatas. Estes anticorpos podem ser encontrados em 60 a 70% de pacientes com Dermatitis hepetiformis (DH) (na doença não-restrita), em aproximadamente 100% de pacientes com doença de Celíaco (DC) e enteropatias de sensibilidade ao gluten (com atrofia vilosa subtotal ou parcial)1,2,5. Há uma pequena porcentagem de pacientes que exibem anticorpos EmA IgG e são negativos para anticorpos IgA quando pequisado.
É recomendado que seja feito um teste de anti-Gliadina para obter a especificidade máxima do teste. Tem sido apresentado que os anticorpos antiendomisio IgA são encontrados na maioria (87%) dos pacientes com doença de Celíaco não tratada e aproximadamente 70% dos pacientes positivos anti-Gliadina (AGA IgA). O R1 anti-Reticulina (R1-ARA) parece ser um marcador menos confiável (com menos de 50% tido como positivo). Estes encontros são baseados na mesma população de pacientes5. Deverá ser notado que uma dieta estrita livre de glúten afetará os resultados de anticorpos em muitos pacientes. O AGA IgA e R1-ARA irão normalmente desaparecer após um ano enquanto que o EmA IgA pode persistir em um título menor. Este teste pode ter um valor prognóstico no monitoramento da dieta.
PRINCÍPIO
A reação de teste primária envolve a presença de anticorpos em soros de pacientes que atacam seus antígenos homólogos EmA. Uma reação secundária então segue um período de enxágüe que remove todos os anticorpos humanos não ligados. O reagente usado na reação secundária é um conjugado de globulina anti-humana marcado com fluoresceína. O antígeno de superfície é então bem enxaguado livre do conjugado não ligado e visualizado em um microscópio de fluorescência para vários padrões morfológicos da fluorescência de EmA que pode ser visualmente identificado.
MATERIAIS FORNECIDOS


  1. Conjugado FITC :

01 frasco com 3,0 ml contendo conjugado anti-humano marcado com FITC com Azul de Evans. Este reagente contém anticorpos que irá reagir com as classes de imunogloblulinas humanas IgA. Deve ser armazenado de 2-8oC ao receber. O conjugado é estável à esta temperatura até a data de vencimento.


  1. Lâminas de antígeno:

12 (doze) lâminas contendo antígenos de setores de esôfago de macaco (setor endomisial). Devem ser armazenadas de 2-8oC ou menos ao receber. Confira o rótulo para data de vencimento específica.


  1. Controle Positivo EmA:

01 frasco com 1.0 ml de Controle Positivo de EmA em soro humano. Deve ser armazenado de 2-8oC ao receber. Confira o rótulo para a data específica de vencimento.
4. Controle Negativo Universal:

01 frasco com 1.0 ml de controle negativo universal em soro humano. Deve ser armazenado de 2-8oC ao receber. Confira o rótulo para a data específica de vencimento.




  1. Envelope de Tampão :

01 envelope contendo Salina Tamponada de Fosfato (PBS). É estável quando armazenado à temperatura ambiente durante 2 anos. Confira o rótulo para vencimento específico. O tampão reconstituido não contém preservativos e deverá ser armazenado de 2-8°C. Deverão ser tomados cuidados para evitar contaminação.


  1. Meio de Montagem :

01 frasco com 10 ml do Meio de Montagem. Deverá ser armazenado de 2-8°C. Confira o rótulo para a data do vencimento específica.
MATERIAIS REQUERIDOS MAS NÃO FORNECIDOS
Estante de tubo de teste ou sistema de microtítulo.

Pipetas descartáveis.

Placa de coloração e pinça de lâminas.

Microscópio de fluorescência

Câmara úmida

Frasco Volumétrico (500 mL)

Água destilada

Lenço de papel - gase


ARMAZENAGEM E ESTABILIDADE
Todos os componentes do kit deverão ser armazenados de 2 - 8oC e são estáveis até a data de vencimento escrito no rótulo.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES


  • Este kit é destinado somente para uso diagnóstico in vitro.

  • Todos os componentes de soro humano foram testados por radioimunoensaio para HBsAg e HTLV-III/LAV e por um método aprovado pelo FDA e foram negativos (não repetidamente reativos). Entretanto, isto não assegura a ausência de HBsAg e HTLV-III/LAV. Todos os componentes de origem humana deverão ser manuseados com cuidado apropriado.

  • A azida sódica (0,01%) incluída nos controles e conjugados é tóxica se ingerida.

  • Não usar os componentes fora da data de vencimento.

  • Siga as instruções do procedimento exatamente como é recomendado nesta instrução para assegurar exatamente se os resultados são válidos.

  • Manuseie as lâminas pelas extremidades, pois a pressão direta nos poços de antígenos pode danificar o antígeno.

  • Uma vez que o procedimento se inicie não permita que o antigeno nos poços sequem. Isto pode resultar em falsos resultados de teste negativos ou artefatos desnecessários.


COLETA, ARMAZENAMENTO E MANUSEIO DA AMOSTRA
Deverão ser colhidas amostras de soro usando condições assépticas. Deve-se evitar hemólise separando o soro do coágulo. Deverá ser armazenado de 2-8 oC se for analisado dentro de poucos dias. O soro pode ser mantido por 3 a 6 meses quando armazenado a -20oC ou menos. Deverão ser evitadas amostras lipêmicas ou muito hemolisadas. Quando as amostras forem transportadas à temperatura ambiente, é recomendado adicionar um preservativo com 0.01% timerosal ou 0,1% de azida sódica.
PROCEDIMENTO DO TESTE
PREPARAÇÃO DOS REATIVOS
Permita que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos antes do uso.


  1. Conjugado FITC: Pronto para uso em frascos de conta-gotas com 3,0 ml do conjugado líquido na diluição

de trabalho.


  1. Controle Positivo EmA: Prontos para uso em frasco de conta-gotas com 1.0 ml de controle líquido na diluição de trabalho.

3. Controle Negativo Universal: Pronto para uso em frasco de conta-gotas com 1.0 ml de controle líquido na

diluição de trabalho.


  1. Envelope de Tampão: Dissolva o conteúdo do envelope em 1 litro de água destilada ou deionizada. Fechar bem para prevenir contaminação ou evaporação.

PROCEDIMENTO


Pesquisa: Dilua o soro teste a 1:10 em PBS.

Titulação: a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, etc. Prepare diluições seriadas de dois passos com PBS.


As amostras podem conter agentes infecciosos e deverão ser manuseadas adequadamente.
Para obter ótimos resultados, NÃO permita que os poços de substrato ressequem enquanto executa o teste.


  1. Remova as lâminas e os reagentes requeridos do refrigerador e deixe-os atingir a temperatura ambiente (15 a 30 minutos).

2. Remova as lâminas da embalagem apenas antes do uso e rotule.




  1. Dilua as amostras com PBS a uma diluição de 1:10 ou prepare diluições seriadas de dois passos para a determinação quantitativa, começando com a diluição de 1:10.




  1. É necessário testar 1 Controle Positivo, 1 Controle Negativo e 1 Controle de PBS para cada bateria de lâminas de teste.

5. Cubra cada poço com as amostras diluídas ou controles.


6. Incube em uma câmara úmida de 23 +/- 2oC por 30 minutos.
7. Enxague as lâminas rapidamente com um leve fluxo de PBS. Não dirija o fluxo direto nos poços.


  1. Enxague as lâminas completamente por 5 minutos em uma placa de coloração de PBS. Troque o tampão e lave por 5 minutos a mais. Manuseie as lâminas levemente.




  1. Seque a parte pintada da lâmina com os mata-borrões fornecidos. Não deixe os poços secarem antes da adição do conjugado.

10. Cubra cada poço com uma gota do conjugado FITC.


11. Incube em uma câmara úmida de 23 +/- 2°C por 30 minutos. Proteja da luz intensa.


  1. Repita os passos 7 e 8. Seque a parte pintada da lâmina com os mata-borrões, não deixe os poços secarem antes da adição do Meio de Montagem.

13. Coloque uma gota do Meio de Montagem em cada poço e cubra com uma lamínula.




  1. Para melhores resultados, as lâminas deverão ser lidas imediatamente a uma magnitude de 200-500X.

Alternativamente, as lâminas podem ser lidas dentro de 24 horas. Porém, elas devem ser armazenadas de 2- 8°C no escuro em uma câmara úmida fechada para prevenir que o fluido de montagem seque.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
A coloração ao redor do endomísio das fibras do músculo liso no esôfago de macaco é considerada positiva. As reações dos pacientes deverão ser comparadas com a reação do controle positivo.
A reatividade do SMA IgA deverá ser considerada e eliminada antes de reportar um EmA positivo.
LIMITAÇÕES


  1. O diagnóstico não deverá ser baseado em um simples teste sorológico, uma vez que vários outros fatores devem ser tomados em consideração.


CONTROLE DE QUALIDADE


  1. Os Controles de soro positivos e negativos devem ser incluídos em cada dia de teste para confirmar a reprodutibilidade, sensibilidade e especificidade do procedimento de teste.




  1. O controle negativo deverá exibir uma pequena ou nenhuma fluorescência. Se a fluorescência for verde-maçã luminoso, o teste é inválido e deverá ser repetido.




  1. O controle positivo representa uma forte (3-4 +) reação. Se intensidade de fluorescência do controle positivo

for menor que a faixa aceitável, o teste é inválido e deverá ser repetido.


  1. Em adição aos soros controles positivo e negativo, deverá ser ensaiado o controle PBS para estabelecer

se o conjugado é livre de coloração não específica do substrato do antígeno. Se o antígeno apresenta uma

fluorescência no controle de PBS, repetir usando um conjugado fresco. Se o antígeno ainda estiver

fluorescente, ou o conjugado ou o antígeno pode estar falhando.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
As características de desempenho do kit de Anticorpos Anti-Endomisial IgA (EmA) foram determinadas testando múltiplos lotes com um painel de soro referência disponível do Centro de Controle de Doenças. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos com outros substratos comercialmente disponíveis Os resultados mostram que os resultados para o Anticorpos Anti-Endomisial IgA (EmA) estiveram dentro da faixa reportada nos estudos da CDC.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


  1. Reunala T, Chorzelski TP, Viander M, et al. IgA anti-endomysial antibodies in dermatitis herpetiformis:

correlation with jejunal morphology, gluten-free diet and anti-gliadin antibodies. Br J Dermatol 1987;117:185-91.

  1. Volta U, Lertzi M, Lazzari R, et al. Antibodies to gliadin detected by immunofluorescence and a micro- ELISA method; markers of active childhood and adult coeliac disease. Gut 1985;26:667-71.

  2. Calabuig M, Torregosa R, Polo P, et al. Serological markers and celiac disease; a new diagnostic approach. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1990;10:435- 42.

  3. Scott H, Ek J, Brandtzaeg P. Changes of serum antibody activities to various dietary antigens

related to gluten withdrawal or challenge in children with coeliac disease. Int Archs Allergy Appl

Immunol 1985;76:138-44.



  1. Volta U, Molinaro N, Fusconi M et al. IgA Antiendomysial Antibody Test A Step Forward in Celiac Disease Screening. Dig. Diseases and Sci. Vol. 36, No 6, June 1991.

  2. Kapuscinska, A., Zalewski, T., Chorzelski, T.P., et al. Disease Specificity and dynamics of Changes In IgA

Class Anti-endomysial Antibodies in Celiac Disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1987; 6:529534.

TERMO DE GARANTIA
Este kit como um todo tem garantia de troca, desde que esteja dentro do prazo de validade e seja comprovado pela Assessoria Científica da HEMAGEN DIAGNÓSTICOS de que não houve falhas técnicas na execução, manuseio do teste e na conservação do produto.
IMPORTADO E DISTRIBUÍDO POR:

HEMAGEN DIAGNÓSTICOS COM. IMP. EXP. LTDA.

Rua Doutor Diogo de Faria, 109 – Vila Clementino

São Paulo - SP - CEP 04037-000

Fone: (0XX11) 3819-5222 Fax: (0XX11) 3816-7623

CGC: 64.002.686/0001-32

Resp. Técnico: Dhália Gutemberg CRF 07.183 - SP


FABRICADO POR:
HEMAGEN DIAGNOSTICS, INC.

VIRGO® PRODUCTS DIVISION

Columbia, Maryland 21045 - USA

Fone: (800) 436-2436 ou 617-890-3748.


SERVIÇO DE ATENDIMENTO AO CLIENTE

Quaisquer dúvidas técnicas, no manuseio deste kit ou no seu procedimento entrar em contato com a ASSESSORIA CIENTÍFICA DA HEMAGEN DIAGNÓSTICOS, que estará sempre à disposição para auxiliar quando ocorrerem dificuldades na utilização de seus produtos. Contate a HEMAGEN através do seguinte endereço:


HEMAGEN DIAGNÓSTICOS COM. IMP. EXP. LTDA.

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DATA DA REVISÃO DAS INSTRUÇÕES DE USO.
Documento Revisado em: - Março de 2014.



ENDOMISIO


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