Atividade antibacteriana in vitro de Agaricus brasiliensis



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ATIVIDADE ANTIBACTERIANA in vitro de Agaricus brasiliensis



Janaina Marques de Almeida, Herta Stutz Dalla Santa, Osmar Roberto Dalla Santa, Susan Michelz Beitel, e-mail: janainamarkes@yahoo.com.br
Universidade Estadual do Centro-Oeste/ Guarapuava/Departamento de Engenharia de Alimentos– Guarapuava – PR.
Palavras-chave: atividade antibacteriana, Agaricus brasiliensis, exapolissacarídeo.


Resumo

O cogumelo Agaricus brasiliensis é um dos cogumelos mais pesquisados e utilizados popularmente devido a presença de diversas substâncias bioativas com vários efeitos benéficos para a saúde. As moléculas com atividade biológica, especialmente os polissacarídeos estão presentes no corpo de frutificação, micélio e caldo de cultivo. Neste trabalho estudou-se a atividade antibacteriana de duas cepas de Agaricus brasiliensis - LPB-03 e SC, através do método de difusão em ágar. Foram testados o micélio seco, a solução de exapolissacarídeo e o caldo de diferentes dias de cultivo. Os resultados demonstraram ausência de atividade antibacteriana contra os microrganismos patogênicos Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphimurium, Listeria monocitogenes e Escherichia coli, nos vários testes in vitro realizados. Estes resultados confirmam que as moléculas bioativas presentes no micélio ou produzidas pelo cogumelo A. brasiliensis não exercem efeitos na ausência do sistema imunológico, ou seja, em testes in vitro.


Introdução
A. brasiliensis tem demonstrado inúmeras potencialidades biotecnológicas, e tem despertado o interesse da indústria farmacológica e alimentícia, devido ao seu valor nutricional e presença de inúmeras substâncias bioativas, que incluem atividade antitumoral, antiarterosclerótica, hipocolesterolêmica, e antimicrobiana em testes in vivo (BERNARDSHAW et al., 2005; OSAKI et al., 1994).

Entre as substâncias com maior potencial biológico produzida por este cogumelo estão os polissacarídeos com propriedades antitumorais e de imunoestimulação. Estes polissacarídeos são substâncias químicas de diferentes composições, a maioria sendo β (1→3) glucanas na cadeia principal, com ramificações β (1→6), cuja estrutura como um todo é necessária para sua ação antitumoral (GERN, 2005). Os polissacarídeos estão presentes no corpo de frutificação, no micélio e no caldo de cultivo. O objetivo deste trabalho foi testar o potencial antibacteriano do exapolissacarídeo (EPS), da biomassa e dos caldos de cultivos do 5º, 7º, 10º, 15º e 20º dia das cepas LPB-03 e SC.


Materiais e Métodos
Para o teste antibacteriano foram utilizados os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus ATCC 25923; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Salmonella tiphimurium ATCC 14028; Listeria monocitogenes ATCC 19111; Escherichia coli ATCC25922. A atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de difusão em ágar e em discos (CLSI/NCCLS, 2005), conforme descrito a seguir: as cepas de microrganismos foram cultivadas em caldo tripticase de soja TSB (106 bactérias), semeadas com swab em placas com TSA. Depois da absorção completa do inóculo, foram feitos poços no meio aos quais foram adicionados os seguintes inóculos:

A) 50 µl de exopolissacarídeo re-suspenso em água a uma concentração de 3,6%, como controle negativo foi utilizado água destilada.

B) 50 µl da biomassa seca re-suspensa em água a uma concentração de 3,6%, como controle negativo foi utilizado água destilada.

C) 50 µl dos caldos de cultivo dos dias 5, 7, 10, 15, 20; concentrado a 50% do volume em rotoevaporador (45ºC), como controle negativo foi utilizado caldo de cultivo utilizado na cinética de crescimento.

Nestes ensaios, como controle positivo foi utilizado gentamicina (50 µl). As placas foram incubadas a 35º C por 24 , 48 e 72 horas. Os ensaios foram realizados em duplicata.
Resultados e Discussão
No teste antibacteriano foi comprovado que a biomassa seca, o exapolissacarídeo e os caldos de cultivo de diferentes dias das duas cepas de A. brasiliensis não apresentaram atividade antibacteriana frente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphymurium, Listeria monocitogenes e Escherichia coli. Uma exceção foi observada com o caldo de cultivo do 15º dia de cultivo da cepa LPB-03 contra Staphylococcus aureus, que resultou em um halo de inibição de 0,4 cm de diâmetro.

Ao contrário do esperado, nos ensaios feitos em difusão em disco com os caldos de cultivo foi observada uma maior proliferação de microorganismos, ou seja, as substâncias (metabólitos) produzidas pelo micélio de A. brasiliensis agem como probióticos, auxiliando no crescimento destas bactérias. Foi verificado um halo de maior concentração de biomassa bacteriana nas placas inoculadas com os caldos de cultivo de A. brasiliensis LPB-03 nos dias 7, 10 e 20, frente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphimurium, Listeria monocitogenes e Escherichia coli.

As placas inoculadas com caldo de cultivo de A. brasiliensis SC dos dias 7 e 10 resultaram em maior crescimento de Listeria monocitogenes e Escherichia coli e o caldo de cultivo do 20º dia propiciou aumento da biomassa de Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocitogenes e Escherichia coli.

Segundo dados da literatura, o cogumelo A brasiliensis apresentou uma excelente atividade bactericida em camundongos que foram tratados com o extrato de A. brasiliensis e inoculados com Streptococcus pneumonia. Os animais apresentaram níveis de bactericemia menores e aumentos de citocinas séricas como MIP-2 e TNF-α. Além disso, nos experimentos in vitro ocorreu ausência da atividade antibiótica, indicando a participação do sistema imunológico. A atuação do cogumelo foi mais efetiva ainda quando o extrato do cogumelo foi dado com 24 horas de antecedência à inoculação das bactérias. Os autores concluem que o extrato do cogumelo pode ser utilizado como agente profilático e possivelmente terapêutico contra bactérias e outras infecções em humanos (BERNARDSHAW et al., 2005).


Conclusões
Para uma análise mais aprofundada da atividade antimicrobiana de A. brasiliensis é necessário a execução de outros ensaios com caldos de cultivo fermentados por mais de 20 dias, uma concentração maior destes caldos, testar substâncias isoladas e concentradas e utilizar outros microorganismos.

A maioria dos resultados encontrados apresentou ausência de atividade antibacteriana tanto da biomassa seca do cogumelo, quanto do EPS e também do caldo de cultivo em testes in vitro, indicando a necessidade da participação do sistema imunológico para exercer sua ação biológica.


Referências
BERNARDSHAW, S.; JOHNSON E.; HETLANDY, G. An Extract of the Mushroom Agaricus blazei Murill Administered Orally Protects Against Systemic Streptococcus pneumoniae Infection in Mice. Scand. J. Immunol.; v. 62, p. 393–398, 2005.

CLSI/NCCLS - Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement. CLSI/NCCLS document M100-S15 [ISBN 1-56238-556-9]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005.



GERN, J. C. Production and characterization of extra-cellular polysaccharide from submerged fermentation by Agaricus brasiliensis, Dissertação, França, 2005.

OSAKI, Y.; KATO, T.; YAMAMOTO, K.; OKUBO, K.; MIYAZAKI, T. Antimutagenic and bactericidal substances in the fruit body of a basidiomycete Agaricus blazei, J. Pharmac. Soc. Japan, v. 114, p. 342-350, jun, 1994.

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