Autor do trabalho: rone aparecido de grandis



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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À FARMÁCIA
AUTOR DO TRABALHO: RONE APARECIDO DE GRANDIS

TÍTULO DO TRABALHO: Avaliação toxicogenética e atividade antitumoral in vitro de complexos heterolépticos de Rutênio(II): Atividades citotóxicas, genotóxicas e interação com biomoléculas
CURSO: Mestrado

DATA DA DEFESA: 24/03/2016

ORIENTADOR: ELIANA APARECIDA VARANDA

ÁREA DE CONHECIMENTO: METAGÊNESE
RESUMO: Os ensaios de toxicologia genética são utilizados como base no desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que podem identificar rapidamente agentes que causam danos ao material genético. Agências regulatórias preconizam a utilização de ensaios que identificam danos genotóxicos, de forma que possam servir como triagem de processos que levam à carcinogênese. Na busca por novos fármacos, a química inorgânica medicinal representa um campo de grande promessa, com potencial de expansão devido a diversidade química e reatividade dos metais. Especialmente, os complexos de rutênio, têm recebido destaque no tratamento de doenças como o câncer e a tuberculose multi-droga resistente (TB-MDR). Neste contexto, este trabalho teve como objetivo, avaliar os efeitos toxicogenéticos e antitumorais de três complexos de rutênio(II), com promissora atividade anti-TB-MDR, denominados de SCAR 4, SCAR 5 e SCAR 6 e, diante da importância do conhecimento farmacocinético de novos fármacos, outro objetivo foi avaliar a permeabilidade in vitro desses complexos. A avaliação toxicogenética foi realizada por meio dos ensaios de mutação gênica reversa com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) e pelo ensaio do micronúcleo citoma com bloqueio da citocinese (CBMN-cit) em ausência e em presença do sistema de metabolização. Ensaios de sobrevivência clonogênica foram utilizados para avaliar a viabilidade das células CHO-K1 e HepG2, utilizadas no ensaio do CBMN-cit. A avaliação da atividade antitumoral foi investigada por meio de ensaios de citotoxicidade frente às linhagens tumorais humanas Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 e MDA-MB-231, pela capacidade de inibição da topoisomerase I humana (Top IB) e por ensaios físico-químicos de interação com o calf thymus DNA (ct-DNA). A permeabilidade foi analisada por meio do ensaio in vitro de permeação em monocamadas de células Caco-2 na presença e ausência de albumina do soro bovino (BSA). A interação dos complexos com albumina foi analisada por meio da medida da supressão da fluorescência dos resíduos de triptofano da BSA. Os resultados mostraram que apenas o complexo SCAR 6 apresentou efeito mutagênico, observado no Teste de Ames e no CBMN-cit e, em ambos os modelos, o efeito foi apresentado apenas quando o complexo fora submetido a sistemas metabolizadores. Na avaliação da citotoxicidade frente às linhagens tumorais, todos os complexos se mostraram seletivos contra as linhagens de câncer de próstata e mama, com destaque para o complexo SCAR 6, que se apresentou seletivo em quatro diferentes linhagens celulares tumorais. Por outro lado, o complexo SCAR 5 foi altamente ativo na inibição da Top IB, seguido do complexo SCAR 4. Ensaios físico-químicos apontaram os efeitos de interação dos complexos com o ct-DNA, confirmando a capacidade do complexo SCAR 6 se ligar ao DNA de forma covalente, enquanto SCAR 4 e 5 apresentaram um perfil de interação eletrostática com o ácido nucleico. SCAR 4 e 5 também apresentaram alta permeabilidade aparente (Papp) in vitro. O complexo SCAR 6 apresentou baixa Papp, sobretudo com a adição de BSA no tampão de permeabilidade, provavelmente devido a alta afinidade pela albumina apresentada nos ensaios de interação com a BSA, onde, os complexos SCAR 4 e 5, apresentaram constante de ligação moderada. Nossos estudos mostraram que os complexos SCAR 4, 5 e 6 apresentam uma afinidade relevante por biomoléculas como DNA, Top IB e albumina. A interação, mesmo que ainda pouco elucidada por esses alvos biológicos, pode sugerir a aplicação terapêutica desses complexos de rutênio, seja interrompendo vias bioquímicas, causando danos no DNA ou, inclusive, interagindo de forma sinérgica, promovendo terapias mais seguras e eficazes.
ABSTRACT: The genetic toxicology assays are used as the basis in the development of new drugs since it’s may rapidly identify agents that cause damage to the genetic material. Regulatory agencies have recommend the use of assays that identify genotoxic effcts, thus they may serve as a screening processes that lead to carcinogenesis. In the search of new molecules for therapeutic purposes, medicinal inorganic chemistry is a major promise of the field, with potential expansion due to chemical diversity and reactivity of metals. Especially, ruthenium complexes, have been highlighted in the treatment of growing diseases such as cancer and multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB). In this context, this study aimed to evaluate the toxicogenetic effects of three ruthenium(II) complex, that showed promising anti-MDR-TB activity, called SCAR 4, SCAR 5 and SCAR 6. In addition to this safety profile, and cosidering the traditionally antitumor activity of ruthenium complexes, this study also aimed to evaluate the antitumor activity of these complexes. In front of the importance of pharmacokinetic knowledge of new drugs, another aim of this study was to evaluate the in vitro permeability of these complexes. The toxicogenetics evaluation was performed by reverse gene mutation assays with Salmonella typhimurium (Ames test) and by Cytokinesis-block micronucleus cytome assay (CBMN-cyt). In both assays, we used models to assess the effect of complexes’s metabolization. The clonogenic survival assays were used to assess the viability of HepG2 and CHO-K1 cells, that it has been used in CBMN-cyt assay. The evaluation of the antitumor activity was investigated by means of cytotoxicity assays with the human tumor cell lines Caco-2, DU-145, HeLa, HepG2 and MDA-MB-231, by the ability to inhibit human topoisomerase I (Top IB) and physico-chemical assays of interaction with the thymus calf DNA (ct-DNA). The permeability was examined by means of in vitro permeation assay with Caco-2 cell monolayers in presence and absence of Bovine Serum Albumin (BSA). The interaction of the complex with albumin was analyzed by measuring the suppression of the fluorescence of tryptophan residues from BSA. In genotoxicity evaluation, only SCAR 6 complex showed mutagenic effect. This effect was observed in the Ames test and the CBMN-cyt and, in both models, the effects were observed only when the complex was subjected to metabolizers systems. In cytotoxicity evaluation, all the complexes showed selective index against prostate and breast cancer cell lines, especially SCAR 6, which was selective in four different tumor cell lines. Moreover, the SCAR 5 complex was highly active in inhibiting Top IB, followed by SCAR 4. Physico-chemical assays showed the effects of interaction of the complexes with ct-DNA, confirming the capacity of SCAR 6 to bind covalently to DNA, while SCAR 4 and 5 showed an electrostatic interaction profile with DNA. SCAR 4 and 5 also showed high apparent permeability (Papp) in vitro. The SCAR 6 complex showed low Papp, especially with the addition of BSA in the permeability buffer, probably due to the high affinity for albumin presented in interaction assays with BSA, where the complexes SCAR 4 and 5 have showed moderate binding. Our studies showed that SCAR 4, 5 and 6 have presented a relevant affinity for biomolecules such as DNA, Top IB and albumin. The interaction, even middling elucidated, by these biological targets, may suggest the therapeutic application of these ruthenium complexes, such as disrupting biochemical pathways, causing DNA damage, or even interacting synergistically, promoting more safer and effective therapies.
BANCA EXAMINADORA:

Titulares:

Profa. Dra. ELIANA APARECIDA VARANDA

Profa. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA

Profa. Dra. LUSÂNIA MARIA GREGGI ANTUNES


Suplentes:

Profa. Dra. PATRÍCIA BENTO DA SILVA



Profa. Dra. DENISE CRISPIM TAVARES
BIBLIOTECA DEPOSITÁRIA:

Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP - Rodovia Araraquara-Jaú, km 1 – Araraquara-SP

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