Células tronco mesenquimais podem serm obtidas de inúmeros tecidos do feto e do indivíduo adulto



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Células Tronco Mesenquimais podem ser obtidas de inúmeros tecidos do feto e do indivíduo adulto

Relatório referente à bolsa de produtividade em pesquisa - CNPq

Dimas Tadeu Covas*

Resumo

Células-tronco são atualmente foco de elevado interesse e atenção, tanto da comunidade científica como da imprensa e da população. Entre elas, as células-tronco da medula óssea ocupam uma posição especial, pois foram os primeiros tipos de células-tronco identificadas, e porque têm sido empregadas em grande número de abordagens terapêuticas. Além do tratamento de doenças hematológicas, numerosas formas de terapia celular novas têm sido testadas com base no uso de células obtidas de medula óssea, notoriamente para tratamento de doenças cardíacas, neurológicas, do diabete melito e reposição de tecidos lesados ou destruído como tecidos ósseo e cartilaginoso, entre outras.

Pelo menos dois tipos de células multipotentes coexistem na medula óssea pós-natal: a célula precursora hematopoética, que origina células maduras do sangue circulante como granulócitos, linfócitos e eritrócitos, e um tipo de célula não hematopoética, conhecida como célula-tronco mesenquimal, que tem capacidade de diferenciar-se in vitro e in vivo em osteoblastos, adipócitos, condroblastos e provavelmente mioblastos. Nosso laboratório em Ribeirão Preto tem se dedicado a estudos que visam melhor caracterizar e esclarecer mecanismos moleculares básicos que explicariam o comportamento e as propriedades desse tipo de célula, que são resumidos no presente trabalho.

Em essência, nossos trabalhos permitiram demonstrar que a célula-tronco mesenquimal tem uma distribuição ampla em tecidos humanos adultos e fetais, e numerosas abordagens que incluem a caracterização morfológica, a avaliação de marcadores de membrana, o potencial de diferenciação e o perfil de expressão gênica demonstram que as células tronco mesenquimais obtidas de fontes muito diversas são muito semelhantes. Além do mais, tipos celulares conhecidos há longo tempo com outras denominações, como fibroblastos e pericitos, demonstram grande semelhança se não identidade com as células-tronco mesenquimais.

Além de seu valor conceitual intrínseco, esses resultados têm um grande potencial de aplicações práticas, em vista do amplo interesse atual na utilização dessas células.

Nota
Além dos trabalhos em andamento em nosso laboratório, cujos resultados parciais são apresentados, o presente texto fundamenta-se nos seguintes trabalhos e teses já publicados:
Covas DT, Piccinato CE, Orellana MD, Siufi JL, Silva WA Jr, Proto-Siqueira R, Rizzatti EG, Neder L, Silva AR, Rocha V, Zago MA. Mesenchymal stem cells can be obtained from the human saphena vein. Experimental Cell Research 309:340-4, 2005
Panepucci RA, Siufi JL, Silva WA Jr, Proto-Siquiera R, Neder L, Orellana M, Rocha V, Covas DT, Zago MA. Comparison of gene expression of umbilical cord vein and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 22:1263-78, 2004
Silva-Jr WA, Covas DT, Panepucci RA, Proto-Siqueira R, Siufi JLC, Zanette DL, Santos ARD, Zago MA – The profile of gene expression of human marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells 21: 661-669, 2003
Covas DT, Siufi JL, Silva AR, Orellana MD. Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 36:1179-83, 2003.
Siufi JLC. [Orientador: Dimas T. Covas]. Isolamento e caracterização de células progenitoras mesenquimais de medula óssea e sangue de cordão umbilica humano Tese de Mestrado. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2004.

* Centro de Terapia Celular – CEPID/FAPESP. Centro Regional de Hemoterapia do Hospital das Clínicas/ Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo. dimas@fmrp.usp.br


Introdução

Aceita-se pacificamente que o embrião contém células-tronco mesenquimais (CTM) multipotentes, capazes de originar uma gama de tecidos que incluem os ossos, as cartilagens, os tendões, os ligamentos, o estroma medular, os adipócitos, a derme, os músculos e demais componentes celulares dos tecidos conectivos (Caplan, 1991).

No indivíduo adulto, a existência de células-tronco mesenquimais multipotenciais na medula óssea (MO) parece estar bem estabelecida. Células-tronco com características semelhantes às das CTM da MO têm sido isoladas de outros tecidos do indivíduo adulto, como por exemplo do tecido gorduroso e da polpa dentária (Zuk et al., 2001; Gronthos et al., 2000). Resta determinar, entretanto, qual a identidade e a distribuição corporal destas células-tronco mesenquimais do adulto.

A hipótese que propomos neste trabalho é que as CTM apresentam ampla distribuição tecidual no organismo adulto, à semelhança do que acontece no embrião, e que estas células podem ser importantes para a regeneração tecidual.


Evidências Iniciais da presença de CTM no indivíduo adulto

A descoberta de que a medula óssea de indivíduos adultos contém uma população de células-tronco multipotenciais distinta das células-tronco hematopoéticas, e capaz de originar diversos tipos célulares como adipócitos, osteoblástos, condrócitos, células do estroma medular e dos tecidos conjuntivos foi o resultado de numerosas pesquisas realizadas nos últimos quarenta anos.

Em 1963, Petrakova e col. demonstraram que fragmentos de medula óssea transplantados sob a cápsula renal de camundongos formavam tecido ósseo que posteriormente era invadido por tecido hematopoético (Petrakova et al., 1963). Quando células da medula óssea eram cultivadas em câmaras de difusão (câmaras delimitadas por membranas semi-permeáveis) também ocorria a formação de osso que, no entanto, não era colonizado por células hematopoéticas .

Alexander Friedenstein e col. demonstraram a distinção entre as células progenitoras hematopoéticas e osteogênicas através de vários experimentos. Em primeiro lugar, transplantaram células da medula óssea de camundongos parentais sob a cápsula renal de camundongos híbridos F1 que eram, portanto, semi-singênicos com os doadores. A análise cariotípica das células do tecido ósseo formado mostrou que as células eram derivadas dos camundongos parentais, enquanto que as células hematopóeticas que colonizaram o osso eram de origem do camundongo receptor F1. Quando era feito o transplante reverso do osso formado no camundongo F1 no camundongo parental, ocorria a formação de novo ossículo mas as células hematopoéticas eram rejeitadas (Friedenstein et al., 1968). Estes estudos mostraram inequivocamente que os precursores hematopóeticos e osteogênicos da MO eram distintos. Estes pesquisadores demonstraram também que células da MO eram capazes de regenerar novos tecidos ósseos em transplantes seriados em receptores secundários, confirmando a capacidade de auto-renovação das células osteogênicas e reafirmando o seu estatus de células tronco. Posteriormente, Fridenstein e col. desenvolveram um método de isolamento de CTM da MO com base na sua capacidade de aderência ao plástico que é utilizado até hoje como o método padrão de isolamento (Friedenstein et al., 1970).

Do conjunto destes experimentos ficou demonstrado que estas células da MO, denominadas originalmente CFU-F (colony forming unit-fibroblast) eram:

a. uma população celular rara da MO (0,01 a 0,001%)

b. não entravam na fase S do ciclo celular antes de 60 horas de cultura

c. possuíam elevada capacidade replicativa

d. eram clonogênicas

e. formavam colônicas de densidade e formato irregular

f. eram capazes de formar tecido ósseo “in vivo” mesmo após terem sido extensivamente cultivadas “in vitro”.

Maureen Owen, em 1985, propôs que as CFU-F seriam as células-tronco que originariam o estroma da medula óssea. Estas células-tronco estromais, à semelhança das células-tronco hematopoéticas, apresentariam uma hierarquia organizacional, possuindo vários compartimentos proliferativos como o das células-tronco propriamente dito, o compartimento das células progenitoras comprometidas e o compartimento de maturação onde se acumulariam as células diferenciadas. Estas células-tronco estromais originariam as células reticulares, os fibroblastos, os adipócitos e os osteócitos medulares (Owen M, 1985).

Em 1991, Arnold I. Caplan propôs que estas células-tronco isoladas da MO de indivíduos adultos seriam as correspondentes às células-tronco mesenquimais do embrião. Propôs também que estas células poderiam ser utilizadas terapeuticamente no tratamento de doenças ósseas e articulares numa modalidade terapêutica que foi denominada Terapia Celular Autóloga (Caplan, 1991).

No final da década de 1990, o aparecimento de evidências experimentais de que células da MO poderiam se diferenciar em tecidos não mesodérmicos como o nervoso e o hepático e o isolamento, cultivo e diferenciação de células embrionárias pluripotencias humanas originaram intensa movimentação científica que acabou por estabelecer o conceito de Medicina Regenerativa. Neste contexto, o interesse no estudo das CTM vem crescendo exponenciamente nos últimos anos.



Caracterização das CTM

As CTM são facilmente isoladas de aspirados da medula óssea obtidos da crista ilíaca superior, da tíbia, do fêmur e da coluna vertebral lombar e torácica de humanos e de grandes mamíferos ( (Digirolamo et al., 1999; Pittenger et al., 1999; D´Ippolito G et al., 1999; Murphy et al., 2003)). A partir de todas estas fontes, o procedimento de isolamento e cultura das CTM é muito semelhante, envolvendo uma fase inicial de separação das células mononucleares em gradiente de densidade, seguido do plaqueamento na concentração variável de 1 x 104 células/cm2 a 0,4 x 106 células/cm2 (Castro-Malaspina et al., 1980; Pittenger et al., 1999). As células são, geralmente, incubadas em meio essencial mínimo suplementado com 10 a 20% de soro bovino fetal. Em cultura, as CTM apresentam uma morfologia fibroblastóide (figura 1A), são aderentes à placa de cultura e capazes de se propagarem por mais de 15 passagens sem sinais de senescência. As culturas primárias geralmente são mantidas por 10 a 15 dias até que as CTM atinjam a confluência. Neste período as células não aderentes, incluindo as hematopoéticas, são depletadas resultando uma cultura relativamente homogênea de CTM em diferentes graus de maturação. Estudos de ciclo celular mostraram que a grande maioria das CTM em cultura encontram-se em fase G0/G1 do ciclo sugerindo elevado potencial de diferenciação (Minguell et al., 2001). O potencial de expansão in vitro das CTM é variável, sendo que algumas preparações crescem por mais de 20 ciclos de duplicação celular sem sinais de senescência e outras não suportam mais do que 3 a 4 ciclos (Bruder et al., 1997b; Digirolamo et al., 1999).

As CTM da MO expressam uma gama de citocinas, receptores de citocinas e fatores de crescimento envolvidos diretamente na manutenção do ambiente estromal (tabela 1) que são importantes elementos reguladores da hematopoese e de outros sistemas celulares presentes na MO (Majumdar et al., 1998; Haynesworth et al., 1996). Também produzem uma série de moléculas da matrix celular, incluindo a fibronectina, laminina, colágenos e proteoglicanos (Tabela 1).



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