Colorimetria e espectrofotometria



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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”

Departamento de Ciências Biológicas


BIOQUÍMICA – LCB 208

ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS








DOCENTES:

Prof. Dr. Daniel Sherer de Moura

Profa. Dra. Helaine Carrer

Prof. Dr. Luiz Antônio Gallo

Prof. Dr. Luiz Carlos Basso





Técnica Responsável: Aline Borges

Piracicaba - SP
2015




SUMÁRIO

AULAS pg

1. Colorimetria e Espectrofotometria 03


2. Determinação de Lactose no leite 07
3. Cromatografia em Papel de Filtro 11

4. Determinação do Teor de Caseína no leite (Reação do Biureto) 16

5. Determinação da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade máxima (Vm) para a Invertase de Levedura 19

6. Reação de Hill (Fotólise da água) 23




COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA


  1. OBJETIVOS

Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz.




  1. FUNDAMENTOS DO MÉTODO

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória, caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) (Figura 1) e que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.



Figura 1. Espectro de absorção de luz em diversos comprimentos de onda ().

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem, que pode ser analisados por um espectrofotômetro (Figura 2). Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende da natureza da substância, de sua concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela luz.





Figura 2. Componentes e funcionamento de um espectrofotômetro para análise da absorção de um determinado comprimento de onda específico de uma solução.

A Lei de Lambert-Beer: a absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constante o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

c = concentração da espécie química absorvente

b = espessura atravessada pelo feixe luminoso

Io= intensidade de luz incidente

I = intensidade de luz emergente (transmitida)

I < Io



Io

Ab = D.O. = K.b.c = log (absorbância ou densidade ótica)

I

A Transmitância ou Transmissão (T%) corresponde a:



I

Io I T = 100 x

100 T Io
I T Io 100

como, = , temos que : =

Io 100 I T

Io 100

portanto, log = log

I T
logo, Ab = log 100 - log T

Ab = 2 – log T



  1. MATERIAL




  • Espectrofotômetro com cubetas

  • Micropipetas de 1 mL

  • Estante com tubos de ensaio

  • Alaranjado de Metila (10µg/mL)

  • Azul de Bromofenol (10µg/mL)



  1. PRÁTICA




  1. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção:




  • Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).

Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) do Alaranjado de Metila (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) ou Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)


Corante:


Tabela 1. Dados de Transmitância e Absorbância do corante analisado pelo grupo






Alaranjado de Metila

(10 µg/mL)

Azul de Bromofenol

(10 µg/mL)

λ (nM)

T

(%)


Ab

(2-logT)


λ (nM)

T

(%)


Ab

(2-logT)


400







400







440







490







460







520







480







540







500







560







520







580







550







590







600







620







700







700








Gráfico 1. Espectro de absorção do corante analisado.


  1. Demonstração da Lei de Lambert-Beer:

Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue. O tubo no 6 estará contendo solução do corante com concentração desconhecida, a qual deverá ser determinada através da Lei de Lambert-Beer.


Tabela 2. Preparo dos padrões de corante e dados de Transmitância e Absorbância.


Tubo

(No)

Água


(mL)

Corante*

(mL)

[Corante]

(g/mL)

Transmitância


(T%)**

Absorbância


(Abs Ou D.O.)

0

5

0










1

4

1










2

3

2










3

2

3










4

1

4










5

0

5










6

5 mL da solução de concentração desconhecida

Encontrar no gráfico

X =







* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol na concentração de 10 µg/mL.

** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto ( máximo).








  • Questionário:




  1. Construir os gráficos do espectro de absorção do outro corante avaliado (Azul de Bromofenol ou Alaranjado de Metila). Utilizar os dados obtidos em aula e do grupo ao lado da bancada.

  2. Explicar a importância de se obter este o pico de absorção de um composto químico para quantificação por espectrofotometria.

  3. Construir o gráfico com os dados da Tabela da 2ª Etapa da aula prática (observado pelo seu grupo) utilizando papel milimetrado. Com o gráfico, considere que foram testadas em aula mais três soluções de concentrações desconhecidas do corante analisado e foram obtidos os seguintes valores de Transmitância (Tabela abaixo). Defina as concentrações desconhecidas e indicar qual das amostras tem maior concentração de corante. (Indicar no Gráfico, no eixo x, os pontos X, Y e Z).



Tubos

Corante (mL)

Água destilada (mL)

T% no λ max.

Ab. λ max.

Conc. Final (µg/mL)

6

5 mL de solução X de corante

32,7







7

5 mL de solução Y de corante

34,5







8

5 mL de solução Z de corante

50,4









DETERMINAÇÃO DE LACTOSE NO LEITE

(MÉTODO DE SOMOGY & NELSON)




  1. OBJETIVO

Determinar a concentração de lactose (açúcar redutor) no leite conservado em geladeira e mantido à temperatura ambiente empregando o método de Somogyi &Nelson.




  1. FUNDAMENTOS DO MÉTODO

Carboidratos que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldeído ou cetona livres (no carbono 1), possuem poder redutor e são por isso denominados açucares redutores. Geralmente, estes açúcares são monossacarídeos ou dissacarídeos que podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férricos (Fe3+) e cúprico (Cu2+). Estes íons, por sua vez, são reduzidos pela ação dos açúcares redutores (agentes redutores). No açúcar, o carbono do grupo carbonila é oxidado a carboxila. É possível determinar a concentração de um açúcar redutor pela medida da quantidade de agente oxidante que é reduzido pela solução desse mesmo açúcar.

A lactose (Figura 1A) é o principal carboidrato do leite, produzida pela glândula mamária, sendo ainda a principal fonte de energia dos recém nascidos. Além disso, a lactose é um dissacarídeo redutor, que reduz o íon cúprico do Reativo de Somogyi a óxido cuproso, em meio alcalino e a quente. Em seguida, o óxido cuproso reage com o ânion arseno-molibdato do Reativo de Nelson produzindo um composto de coloração azul - óxido de molibdênio, Mo2O3, com λ máx.= 540 nm (Figura 1B).

Dentro de certos limites, a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à quantidade de lactose no leite. Essa intensidade de coloração pode ser medida utilizando-se um espectrofotômetro, que detecta a absorção de luz pelo óxido de molibdênio.





Figura 1. (A) Estrutura molecular do dissacarídeo lactose (β-galactose 1,4  α-glicose), evidenciando o carbono 1 contendo o grupo aldeído da glicose, envolvido em ligação hemiacetal (região redutora). (B) Reações envolvidas no método de Somogyi & Nelson, mostrando a formação do óxido de molibdênio, Mo2O3, um composto de coloração azul, com máx.= 540 nm.
Antes da reação quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada, mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.


  1. MATERIAL




  • Espectrofotômetro

  • Centrífuga de mesa

  • Banho-maria (ebulição)

  • Balão volumétrico de 100 mL

  • Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrífuga

  • Micropipetas de 1mL

  • Hidróxido de bário 0,3N

  • Sulfato de zinco 5%

  • Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato de sódio dibásico ou monoácido e 40 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 ml de água. Adicionar 100 ml de NaOH 1N. Gotejar, sob agitação constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar 180 gramas de sulfato de sódio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37ºC. Filtrar antes do uso.

  • Reativo de Nelson: dissolver 50 gramas de molibdato de amônio em 900 ml de água destilada. Cuidadosamente, adicionar 52 ml de ácido sulfúrico concentrado. Adicionar 3 gramas de arseniato dibásico de sódio dissolvido em 50 ml de água. Completar para 1 litro e manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso e filtrar.

  • Padrão de lactose: dissolver 0,1 gramas de lactose pura em um litro de água. Esta solução conterá 100 g/mL.




  1. PRÁTICA




  1. Preparar 5 tubos, adicionando lactose (100 g/mL) e água destilada conforme quadro abaixo. Em seguida, acrescentar em cada tubo 1 mL do Reativo de Somogyi e agitar. Deixar em banho-maria fervente por 5 minutos. Esfriar em água corrente.

  2. Adicionar 1 ml do Reativo de Nelson e agitar. Completar o volume a 10 mL, adicionando 7 ml de água destilada.

  3. Fazer leitura em espectrofotômetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:


Tabela 1. Preparo dos padrões de Lactose e obtenção dos dados de Transmitância, Absorbância e Δ Absorbância.



TUBO

(No)

ÁGUA

(ml)

Lactose

100 g/mL

(mL)

[Lactose] (g/mL)

Reat. Somogy (mL)

Banho

Maria

Reat.

Nelson (mL)

Compl. Vol.

(10 mL)

Transmit.

(T%)

Absorb.

 nm



Absorb.

 nm



0

1,0

0




1,0

Incubar a 100ºC por 5 min

1,0

7 mL










1

0,7

0,3




1,0

1,0

7 mL










2

0,4

0,6




1,0

1,0

7 mL










3

0,1

0,9




1,0

1,0

7 mL










4

0

1,0




1,0

1,0

7 mL











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