Cromatografia Líquida de Alta Eficiência



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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Departamento de Ciência dos Alimentos

Bacharelado em Química de Alimentos

Seminários em Alimentos



Avanços na Cromatografia Líquida

Josiane Kuhn Rutz

Pelotas, 2009

JOSIANE KUHN RUTZ



AVANÇOS NA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA



Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Química de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial da disciplina de Seminários em Alimentos.

Orientador: Fabrízio Barbosa

Pelotas, 2009




Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de tentar, pois o medo nos afasta das derrotas, mas das vitórias também.
(Autor desconhecido)





Resumo


RUTZ, Josiane Kuhn. Avanços na cromatografia líquida. 2009. 41f. Trabalho acadêmico (Seminário em Alimentos) - Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.


Podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os métodos analíticos modernos, devido a facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas. Trata-se de um método físico-químico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis (fase móvel e estacionária). Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das técnicas de separação, a cromatografia líquida de alta eficiência utiliza pequenas colunas, nas quais uma fase móvel líquida que é bombeada a alta pressão e elui sobre a fase estacionária que está em seu interior, esta é formada de partículas com diâmetro de 3 a 10μm, assim, os solutos com maior afinidade com a fase móvel serão eluídos primeiro e posteriormente os que têm maior afinidade com a fase estacionária. Quanto menor o tamanho da partícula, maior será a eficiência da coluna e maior a resistência à vazão. As fases estacionárias mais utilizadas são as que contêm partículas de sílica microporosa ligada covalentemente com grupos octadecil (C18H37). O método dispõe de diferentes mecanismos de separação podendo ser de: partição, adsorção, fase ligada, troca iônica ou exclusão de tamanho. Pode ser efetuada em fase normal, fase estacionária polar e fase móvel apolar, ou em fase reversa, fase estacionária apolar e fase móvel polar. O equipamento é dotado de um sistema de abastecimento e programadores da fase móvel, podendo esta ser isocrática ou de gradiente, bombas de alta pressão, injetor, coluna, e detectores, sendo o registro dos dados feito por um registrador, integrador ou mesmo um microcomputador, que também é utilizado na programação de todas as etapas do processo.
Palavras-chave: Cromatografia. HPLC. Análise Quantitativa. Separação



Lista de Figuras




Figura 1 - Tipos de cromatografia.....................................................................

9

Figura 2 - Etapas da cromatografia líquida clássica.........................................

13

Figura 3 - Etapas da cromatografia líquida de alta eficiência...........................

14

Figura 4 - Estrutura esquemática da sílica gel..................................................

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Figura 5 - Reação de silanização de um cloro-silano substituído com silanol..

21

Figura 6 - Esquema de troca iônica da cromatografia por troca iônica............

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Figura 7 - Esquema do cromatógrafo líquido....................................................

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Figura 8 - Programador de fase móvel a baixa pressão...................................

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Figura 9 - Programador de fase móvel a alta pressão......................................

28

Figura 10 - Bomba pneumática.........................................................................

29

Figura 11 - Bomba recíproca............................................................................

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Figura 12 - Bomba do tipo seringa....................................................................

31

Figura 13 - Medidor de pressão Bourbon ........................................................

31

Figura 14 - Medidor de pressão do tipo transdutor de pressão........................

32

Figura 15 - Válvula rotatória de amostragem para HPLC.................................

33

Figura 16 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC............................................

33

Figura 17 - Cromatograma típico da separação dos tocoferóis em amora-preta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescência a 290nm de excitação e de 330nm de emissão....................

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L

ista de Tabelas





Tabela 1 - Principais características da CG e HPLC........................................

15

Tabela 2 - Tipos de fases estacionárias para HPLC........................................

18

Tabela 3 - Fases móveis e estacionárias mais utilizadas na CLL....................

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Tabela 4 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionárias de cromatografia líquida com fase ligada..............................................................

21


Tabela 5 - Classificação das colunas de separação.........................................

35

Tabela 6 - Detectores utilizados na HPLC........................................................

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S

umário



1 Introdução...................................................................................................

7

2 Cromatografia.............................................................................................

8

2.1 Conceito e histórico..................................................................................

8

2.2 Tipos de cromatografia.............................................................................

9

3 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)........................................

12

3.1 História e Conceito...................................................................................

12

3.2 Diferenças entre HPLC e a cromatografia líquida clássica (CLC)...........

13

3.3 Comparação da HPLC com a cromatografia gasosa (CG).....................

14

3.4 Fases........................................................................................................

15

3.4.1 Fase Móvel (FM)...................................................................................

15

3.4.2 Fase Estacionária (FE)..........................................................................

16

3.5 Mecanismos da HPLC..............................................................................

19

3.5.1 Líquido-líquido ou partição ...................................................................

19

3.5.2 Líquida com fase ligada........................................................................

20

3.5.3 Líquido-sólido ou absorção...................................................................

22

3.5.4 Cromatografia por troca iônica..............................................................

23

3.5.5 Cromatografia por exclusão..................................................................

24

3.6 Equipamentos..........................................................................................

25

3.6.1 Sistema de abastecimento da fase móvel ............................................

26

3.6.2 Programadores de fase móvel..............................................................

27

3.6.3 Sistema de bombeamento....................................................................

28

3.6.4 Medidores e controladores de pressão.................................................

31

3.6.5 Sistema de injeção da amostra.............................................................

32

3.6.6 Coluna...................................................................................................

33

3.6.7 Detectores.............................................................................................

35

3.6.8 Registro de dados.................................................................................

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3.7 Aplicações................................................................................................

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4 Conclusão...................................................................................................

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Referências....................................................................................................

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1 Introdução
Desde o início do século passado a cromatografia vem sendo utilizada como técnica analítica, tendo seus métodos aperfeiçoados com o passar dos anos. Inicialmente era usada para separação de substâncias coradas, de onde lhe deriva o nome, mas atualmente a técnica é utilizada para separar uma grande variedade de compostos, que só ocasionalmente apresentam coloração (LANÇAS, 1993; GONÇALVES, 2001).

Diferentes critérios são utilizados para distinguir os métodos cromatográficos, estes podem ser separados quanto ao mecanismo de separação, técnica empregada, tipo de fase utilizada e tipo de superfície na qual ocorre a separação, podendo ser cromatografia em coluna, quando ocorre dentro de um tubo, ou cromatografia planar, quando ocorre em uma superfície plana (LANÇAS, 1993).

A cromatografia em coluna divide-se em cromatografia gasosa, cromatografia com fluído supercrítico e cromatografia líquida, podendo esta última ser classificada em cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência, tema que será abordado no presente trabalho (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).

Somente por volta dos anos 60 que a tecnologia permitiu o uso de colunas empacotadas com partículas de diâmetro da ordem de 3 a 10μm, sendo fabricados aparelhos sofisticados que trabalhassem a alta pressão, ao contrário do que acontecia com as colunas de vidro simples da cromatografia líquida clássica, em que a eluição da fase líquida era devido somente a ação da gravidade. Desde então o nome cromatografia líquida de alta eficiência começou a ser utilizado para distinguir esta nova técnica dos métodos básicos, que ainda são usados em análise preparativa (GONÇALVES, 2001).

Apresentar o histórico, assim como os mecanismos de separação, equipamentos e aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência são os principais objetivos deste trabalho.


2 Cromatografia
2.1 Conceito e histórico
Devido a facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação de espécies químicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os métodos analíticos modernos, podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise (COLLINS,1997).

Sendo a cromatografia um método físico-químico, ela fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária, e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).

Atribuida ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, a descoberta da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, quando este descreveu sua experiência na separação dos componentes de extrato de folhas. Neste estudo o botânico conseguiu separar pigmentos de cloroplastos em folhas verdes de plantas, onde usou uma coluna de vidro recheada com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como fase móvel, ocorrendo a separação de componentes em faixas coloridas, este fato deu origem ao nome de cromatografia (chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo não dependa da cor. Apesar de estudos semelhantes terem sido desenvolvidos, Tswett foi o primeiro a compreender e interpretar este processo como é aceito atualmente, empregando o termo cromatografia para descrever as zonas coloridas que se moviam dentro da coluna (LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).

A técnica cromatográfica foi praticamente ignorada até a década de 30 quando foi redescoberta por Kuhn e Lederer que apefeiçoaram a cromatografia em coluna, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando um experimento semelhante ao de Tswett, com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como fase móvel. Apartir daí a cromatografia foi aperfeiçoada e em conjunto com os avanços tecnológicos esta foi levada a um alto grau de sofisticação que resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas (LANÇAS, 1993; COLLINS,1997).


2.2 Tipos de Cromatografia
A classificação dos métodos cromatográficos pode ser quanto ao mecanismo de separação, quanto a técnica empregada e em relação ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificação mais popular é a que leva em consideração o tipo de superfície na qual ocorre a separação (Fig.1), sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar (LANÇAS, 1993).

Cromatografia









Planar Coluna


Clássica

Fluído Supercrítico

Camada delgada

Papel

Líquida

Gasosa

HPLC

Figura 1 - Tipos de cromatografia.

Fonte: DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998.



2.2.1 Cromatografia em coluna
A separação ocorre no interior de um tubo de vidro ou metal. De acordo com o estado físico da fase móvel distingui-se a cromatografia gasosa, cromatografia líquida e a cromatografia de fluído supercrítico (LANÇAS, 1993).
2.2.1.1 Cromatografia gasosa
Neste método a fase estacionária pode ser sólida, com uma grande área superficial, ou líquida, onde uma película delgada líquida recobre um sólido inerte; e a fase móvel é um gás denominado gás de arraste, sendo este inerte tem a finalidade de transportar as moléculas a serem separadas. Assim, uma corrente de gás elui continuamente pela coluna e quando a amostra é vaporizada ela se introduz nesta corrente sendo arrastada através da coluna (LANÇAS, 1993; BONATO, 1997).
2.2.1.2 Cromatografia líquida
A fase estacionária utilizada neste método, como na cromatografia gasosa, pode ser um sólido ou um líquido e como fase móvel utiliza-se um líquido no qual o soluto está dissolvido, assim, enquanto a fase móvel elui sobre a fase estacionária os solutos são separados de acordo com a interação destes com as fases, sendo eluído primeiro os que têm maior afinidade com a fase móvel e posteriomente os que têm maior afinidade com a fase estacionária. A cromatografia líquida pode ser dividida em:

Cromatografia líquida clássica (CLC): este método utiliza colunas com diâmetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionárias finamente divididas, pelas quais passam as fases móveis sob ação da gravidade. Separa misturas bastante complexas, porém é demorada e necessita que seja feito exame químico ou espectroscópico das frações coletadas (VOGEL, 2002).

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC): Utiliza colunas fechadas que contêm partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes, são utilizadas altas pressões para forçar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da análise (HARRIS, 2005).
2.2.1.3 Cromatografia com fluído supercrítico (CSC)
Neste método um gás ou um líquido no estado supercrítico é utilizado como fase móvel, possuindo propriedades do solvente que se situam entre as de um líquido e de um gás. Acima do ponto triplo existe uma pressão na qual o líquido e o vapor estão como fases separadas, acima do ponto crítico, independente da pressão, existirá apenas uma fase que é chamada de fluído supercrítico. Quando comparada com a cromatografia líquida este método proporciona um aumento na resolução e na velocidade, pois o coeficiente de difusão do soluto é maior em fluídos supercríticos, já em relação à cromatografia gasosa este tem menor resolução e velocidade, mas é capaz de dissolver solutos não-voláteis (LANÇAS, 1993; HARRIS, 2005).
2.2.2 Cromatografia planar
A separação ocorre em uma superfície plana, geralmente uma placa de vidro ou metal, impregnado com a fase estacionária ou então em uma folha de papel embebida com um solvente apropriado. Este método divide-se em cromatografia em camada delgada e cromatografia em papel (LANÇAS, 1993).
2.2.2.1 Cromatografia em camada delgada
A separação consiste no deslocamento diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. O processo de separação fundamenta-se na adsorção, mas quando são utilizadas fases estacionárias tratadas pode ocorrer partição ou troca iônica, podendo então ser utilizada tanto na separação de substâncias hidrofóbicas como hidrofílicas (LOPES, 1997).

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