Cultura de microrganismos – necessidades nutritivas



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Microbiologia Médica 2006/2007

Aula Prática n.º 3

Cultura de microrganismos – necessidades nutritivas. Meios de cultura: composição,

preparação, armazenamento, utilização. Técnicas de sementeira.


CULTURA DE MICRORGANISMOS - MEIOS DE CULTURA





  • Conhecer as características gerais dos meios de cultura relativamente a composição.

  • Conhecer as condições de incubação dos meios de cultura.

  • Compreender a grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos.

  • Compreender a utilidade do exame cultural.

  • Conhecer a classificação geral dos meios de cultura.

  • Conhecer e caracterizar meios de cultura comuns no laboratório.

  • Saber escolher meios de cultura consoante os objectivos pretendidos.

  • Conhecer as técnicas de preparação de meios de cultura desidratados.



Texto de apoio:
Meios de cultura: composição, preparação e uso.

Preparação de alguns meios de cultura.

MEIOS DE CULTURA
INTRODUÇÃO
O estudo microscópico das características morfológicas (dimensão, forma e tipo de associação) e das características de coloração é, geralmente, insuficiente para a obtenção de uma identificação satisfatória do agente patogénico. Assim, para conhecer as propriedades, fisiológicas e bioquímicas é necessário cultivar as células microbianas no laboratório. A cultura de microrganismos consiste no crescimento de populações microbianas em meios de cultura laboratoriais. Uma cultura que tem apenas um tipo de microrganismo é conhecida por cultura pura, uma cultura que tem mais do que um tipo de microrganismo é uma cultura mista. A cultura de microrganismos consiste num passo rotineiro do exame microbiológico, sendo feito simultaneamente com o exame microscópico ou imediatamente depois.
Com a cultura de microrganismos pretende-se:


  • Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em número reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a identificação.

  • Procurar isolar os tipos de microrganismos existentes numa população microbiana mista.

  • Diferenciar entre grupos de microrganismos através da aparência macroscópica das colónias e das reacções bioquímicas com o meio.

  • Caracterizar e identificar os microrganismos através das características das suas colónias, em um ou mais meios de cultura, e pelas suas capacidades de produzirem alterações químicas em diferentes meios de cultura.

  • Quantificar microrganismos.

  • Analisar substâncias de ocorrência natural.

CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS MEIOS DE CULTURA
Para a cultura de microrganismos é necessário existirem meios de cultura apropriados que simulem ou até melhorem as condições naturais do ambiente em que se desenvolvem.

Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratório.

A sobrevivência e o crescimento dos microrganismos depende de um adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente físico favorável. No entanto, há uma grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e por isso é que só compreendendo as suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de microrganismos no laboratório.

Composição dos meios de cultura

Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e proporções correctas para a manutenção e multiplicação dos microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substâncias de baixo peso molecular que são, frequentemente, derivadas da degradação enzimática de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensáveis ao organismo em causa devem estar sob forma assimilável.

As necessidades nutricionais dos microrganismos são satisfeitas no laboratório através da variedade de meios de cultura existentes. Os microrganismos têm necessidades nutricionais variáveis de acordo com a espécie, no entanto, há determinadas substâncias cuja necessidade é comum a todos.

Constituintes essenciais ou básicos




Água


A água é um componente importante e sempre presente em altas quantidades. Todas as células requerem água no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular. A água utilizada nos meios de cultura deve ser destilada, pois a água de consumo contém minerais que podem reagir com os constituintes do meio formando precipitados, além de substâncias antisépticas (ex. cloro) que podem interferir com o crescimento microbiano.

Fonte de energia


As actividades metabólicas das células só podem ocorrer se houver energia disponível na célula. Os microrganismos podem ser divididos em duas categorias de acordo com a sua fonte de energia:

- fototróficos: usam a energia radiante como única fonte de energia, através da fotossíntese.

- quimiotróficos: dependem da oxidação de compostos químicos como fonte de energia. Alguns microrganismos usam moléculas orgânicas (como a glicose), enquanto outros usam compostos inorgânicos (como o H2S e o NaNO2).

Fonte de carbono


O carbono é um elemento essencial necessário ao crescimento microbiano. Entre os microrganismos há duas categorias de acordo com as suas necessidades nutricionais:

- autotróficos: usam carbono inorgânico na forma de dióxido de carbono como única ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de cultura só com compostos inorgânicos, pois não necessitam de compostos orgânicos e podem ser inibidos por eles.

- heterotróficos: usam compostos orgânicos como principal fonte de carbono. Estes microrganismos não podem ser cultivados num meio só com compostos inorgânicos, pois eles necessitam de nutrientes orgânicos, principalmente glicose.

Fonte de hidrogénio e de oxigénio


As necessidades de hidrogénio e de oxigénio são, geralmente, satisfeitas ao mesmo tempo que as de carbono, uma vez que esses elementos fazem parte de muitos compostos, usados como fonte de carbono e de energia.

Fonte de azoto


O azoto é também um elemento essencial para a síntese de muitas macromoléculas celulares particularmente proteínas e ácidos nucleicos.

Alguns microrganismos utilizam o azoto atmosférico (N2), outros contam com compostos inorgânicos como a amónia e os sais de nitrato, enquanto outros necessitam de compostos orgânicos que contêm azoto como os aminoácidos.

Uma das principais fontes de azoto de origem comercial são as peptonas. Estas são obtidas a partir da hidrólise ácida, alcalina ou enzimática de matérias proteicas de origem animal ou vegetal e incluem aminoácidos, peptídeos e polipeptídeos. As peptonas são hidrossolúveis e não coaguláveis pelo calor o que permite que os meios de cultura sejam esterilizados no autoclave.

Fonte de enxofre e de fósforo


O enxofre faz parte de alguns aminoácidos e por isso é um componente das proteínas. As suas fontes incluem compostos orgânicos como os aminoácidos sulfurados, compostos inorgânicos como os sulfatos, e ainda o enxofre elementar.

O fósforo é necessário para a formação dos ácidos nucleicos e para a síntese dos compostos orgânicos de alta energia - adenosina trifosfato (ATP). O fósforo é fornecido na forma de sais de fosfato para ser usado por todas as células microbianas.



Elementos metálicos


A maior parte das células necessita de alguns iões metálicos como cálcio, potássio, magnésio, ferro, manganésio, zinco, cobre, molibdénio, níquel, cobalto e sódio para as suas várias actividades celulares. Estes iões são necessários em quantidades ínfimas (micronutrientes), sendo usados como cofactores e activadores de enzimas.

Factores de Crescimento:


São substâncias essenciais para o metabolismo bacteriano, pois são componentes celulares ou precursores desses componentes que não podem ser sintetizados pelos microrganismos (aminoácidos, purinas, pirimidinas e vitaminas). Os microrganismos que não conseguem sintetizar esses componentes dentro da célula necessitam de uma fonte externa.

As vitaminas são substâncias orgânicas que contribuem para o crescimento celular e são essenciais, em pequenas concentrações, para as actividades celulares. São também fontes de coenzimas que são necessárias para a formação de sistemas enzimáticos activos.

São factores de crescimento o sangue (factores x e v e soro), aminoácidos, extracto de leveduras, líquido ascítico, etc. A acção de algumas destas substâncias reside na sua capacidade de adsorver substâncias tóxicas do meio exterior.
Substâncias Inibidoras:

Incluem corantes, antibacterianos, sais biliares, NaCl, alteração do pH, etc.


Indicadores de pH:
Indicam se o microrganismo é ou não capaz de utilizar o substrato alterando o pH e originando mudanças de cor do meio de cultura.

Substâncias solidificantes (inertes):


São aquelas que conferem consistência ao meio. Utilizam-se o agar ou gelose, a gelatina e o gel de sílica.


Condições de incubação dos meios de cultura

Para que haja crescimento microbiano é necessário que um meio de cultura forneça nutrientes, mas também é preciso que forneça um ambiente físico adequado a cada microrganismo.

A temperatura, o pH e a atmosfera gasosa são três dos mais importantes factores físicos que influenciam o crescimento e sobrevivência dos microrganismos.

Temperatura

O crescimento microbiano depende directamente de como a temperatura afecta as membranas, os ribossomas e outros componentes e as enzimas celulares. Com o aumento da temperatura, a actividade enzimática aumenta até ao ponto em que ocorre desnaturação irreversível da estrutura proteica das enzimas. Geralmente, temperaturas da ordem dos 70º C destroem a maioria das enzimas essenciais e causam morte celular. Por outro lado, à medida que a temperatura baixa ocorre inactivação das enzimas e o metabolismo celular diminui gradualmente levando consequentemente à inibição do crescimento celular (aos 0º C as reacções bioquímicas cessam na maior parte das células).


Cada microrganismo requer um intervalo de temperatura limitado de acordo com a sensibilidade dos seus sistemas enzimáticos ao calor. Assim, para cada espécie temos a considerar:

- Temperatura mínima de crescimento: é a temperatura mais baixa à qual o crescimento ainda ocorre. Abaixo desta temperatura a actividade enzimática é inibida e as células ficam metabolicamente inactivas de modo que o crescimento pára.

- Temperatura máxima de crescimento: é a temperatura mais alta à qual o crescimento ainda ocorre. Acima desta temperatura a maior parte das enzimas é destruída e o organismo morre.

- Temperatura óptima de crescimento: é a temperatura à qual a taxa de reprodução é máxima, o microrganismo cresce mais rapidamente; no entanto, não é necessariamente a temperatura óptima ou ideal para as outras actividades enzimáticas da célula. A temperatura óptima para uma espécie microbiana não fica no meio do intervalo de temperatura, é mais próxima do limite superior. A temperatura óptima de um determinado microrganismo está correlacionada com a temperatura do seu habitat normal.


Os microrganismos podem ser classificados em três grandes grupos atendendo às suas exigências de temperatura:

Psicrófilos


Crescem abaixo dos 20º C, sendo a sua temperatura óptima de 15º C ou mais baixa. Uma das características deste grupo é o facto de crescerem entre os 0 e os 10º C, o que permite, por exemplo, que possam crescer em alimentos armazenados no frigorífico. Alguns crescem a temperaturas inferiores a 0º C e por isso em alimentos congelados.

Mesófilos


Crescem entre os 20 e os 45º C. Têm capacidade para crescer à temperatura do corpo humano (37º C) e assim neste grupo inclui-se a grande maioria dos microrganismos patogénicos.

Termófilos


Crescem a temperaturas superiores a 45º C, sendo o óptimo entre os 50 e os 60º C. Algumas bactérias são capazes de sobreviver à fervura, mesmo que não sejam capazes de crescer (termodúricos). Muitos dos formadores de esporos suportam a ebulição durante 15 minutos devido aos seus resistentes endósporos.
pH

O crescimento e sobrevivência dos microrganismos é muito influenciado pelo pH do meio ambiente e cada espécie tem a capacidade de crescer dentro de um intervalo (mínimo, óptimo e máximo) específico de pH. O pH óptimo para o crescimento microbiano, para o qual é máxima a multiplicação, é aproximadamente no meio do intervalo de pH onde o crescimento ocorre.

O aumento ou diminuição do pH leva a uma diminuição da taxa de reacções químicas devido à destruição das enzimas celulares e por conseguinte afecta a taxa de crescimento e finalmente a sobrevivência do microrganismo.

Diferentes espécies de microrganismos têm diferentes tolerâncias de pH e estes pH específicos reflectem a adaptação do organismo ao seu ambiente natural. No entanto, há determinadas espécies que estão adaptadas para crescer a vários valores da escala de pH.

Os microrganismos acidófilos crescem a baixos valores de pH (1-5,5), os alcalófilos desenvolvem-se a valores elevados de pH (8,5-11,5) e os neutrófilos preferem pH 5,5-8.

Pode-se considerar que para a maioria das bactérias o pH mínimo para o crescimento é 4 e o máximo é 9, sendo o óptimo entre 6 e 8 (neutrófilos). Os fungos preferem ambientes ligeiramente ácidos, sendo o seu pH óptimo entre 4 e 6.

Os meios de cultura estão ajustados para um pH à volta de 7, pois é este o valor geralmente mais vantajoso para o crescimento da maioria das bactérias. É preciso ter em conta que as actividades metabólicas dos microrganismos levam à produção de compostos ácidos (a partir da degradação dos hidratos de carbono) ou básicos (a partir da degradação proteica) que causam alterações no pH do meio que podem inibir o crescimento dos microrganismos. Para evitar grandes variações de pH é necessário adicionar tampões aos meios de cultura (adição de concentrações equimolares de sais de ácidos fracos e sais de bases fracas). Muitos meios contêm aminoácidos, peptonas e proteínas que devido às suas propriedades anfotéricas, funcionam como tampões naturais.

Atmosfera gasosa

Os microrganismos apresentam uma grande diversidade em relação à sua capacidade de usar o oxigénio livre para a respiração celular. Estas variações nas necessidades de oxigénio reflectem as diferenças nos sistemas enzimáticos bioxidativos presentes nas várias espécies. Na maior parte das células o oxigénio atmosférico é necessário para o processo bioxidativo da respiração, no entanto há células que não tem o sistema enzimático para a respiração em presença do oxigénio e por conseguinte necessitam de usar uma forma anaeróbia de respiração ou fermentação.


Assim, os microrganismos são classificados em grupos fisiológicos atendendo ao seu comportamento em relação ao oxigénio:
Aeróbios estritos (ex. Mycobacterium, Legionella, fungos filamentosos)

São os que necessitam da presença de oxigénio para crescer e podem fazê-lo numa atmosfera com 21 % de oxigénio (“ao ar”). Estão dependentes da respiração aeróbia, utilizando o oxigénio como aceitador final de electrões.


Microaerófilos (ex. Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni)

Necessitam de oxigénio como os aeróbios, mas só conseguem crescer com concentrações de oxigénio menores do que as que existem na atmosfera ( 21%); crescem melhor com concentrações de oxigénio entre 1 e 15%.


Anaeróbios estritos (ex. Clostridium botulinum)

São aqueles que podem ser “intoxicados” pelo oxigénio, que não crescem na atmosfera e não usam o oxigénio. Obtêm energia por processos que não envolvem a utilização de oxigénio (usam processos fermentativos ou respiração anaeróbia).

Nestes organismos a presença de oxigénio atmosférico leva à formação de metabolitos tóxicos como o peróxido de hidrogénio e o radical superóxido (O2-), visto que não possuem as enzimas dismutase do superóxido (converte o ião superóxido em peróxido de hidrogénio) e catálase e/ou peroxidases (convertem o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio).

Por conseguinte pequenas quantidades de oxigénio atmosférico são letais para estes microrganismos. No laboratório, utilizam-se jarras de anaerobiose em que o oxigénio é removido retirando-se o ar ou por reacção química.


Anaeróbios aerotolerantes (ex. bactérias lácticas)

São aqueles que não beneficiam do oxigénio, pois são organismos que utilizam, exclusivamente, processos metabólicos anaeróbios (fermentação). Crescem igualmente bem na presença de oxigénio, pois produzem catálase e/ou superóxido dismutase (ao contrário dos anaeróbios).


Aeróbios ou anaeróbios facultativos (ex. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae):

São aqueles que crescem em presença ou em ausência de oxigénio. No entanto, crescem melhor em presença do que em ausência de oxigénio, não sendo dependentes do oxigénio atmosférico. Usam preferencialmente o oxigénio para a respiração aeróbia, mas num meio pobre em oxigénio utilizam processos bioenergéticos como a fermentação ou a respiração celular anaeróbia, utilizando compostos como nitratos ou sulfatos como aceitadores finais de electrões.


Procedimentos para determinar as necessidades de oxigénio:
As necessidades de oxigénio podem ser determinadas inoculando-se o microrganismo em questão num tubo de ensaio contendo o meio sólido fundido, agitando-se o tubo para dispersar os microrganismos através do meio e por fim deixando solidificar o meio para assegurar que as células fiquem dispersas. Após incubação, o microrganismo vai crescer na parte do meio que contém a concentração apropriada de oxigénio, mostrando quais as suas necessidades:


  • aeróbios estritos: apresentam crescimento à superfície.

  • anaeróbios estritos: o crescimento é limitado ao fundo do tubo.

  • anaeróbios facultativos: apresentam crescimento através de todo o meio, mas predominando na parte superior do tubo.

  • anaeróbios aerotolerantes: apresentam crescimento uniforme através de todo o tubo.

  • microaerófilos: crescem numa zona ligeiramente abaixo da superfície.

CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA



Composição Química




Quimicamente definidos ou sintéticos


São constituídos por quantidades conhecidas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas quimicamente puras e bem definidas, ou seja, a sua composição química é conhecida.

Estes meios são, geralmente, usados na cultura de microrganismos autotróficos, como as algas, ou de microrganismos heterotróficos pouco exigentes.

Podem ser usados para determinar as necessidades nutricionais precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um constituinte a este tipo de meios permite verificar se esse constituinte é essencial ou não para o crescimento de um determinado microrganismo.

Quimicamente complexos ou artificiais

Resultam da adição de substâncias naturais de composição química mal definida a um meio sintético, ou seja, a composição química exacta não se conhece.

São usados para simular e até melhorar o ambiente natural dos microrganismos a ser estudados. São usados por rotina na cultura de microrganismos

São compostos por um número limitado de substâncias complexas, extractos de plantas ou animais, cujas composições químicas exactas não são conhecidas: extracto de carne, peptonas (proteínas parcialmente degradadas por enzimas como os hidrolisados de caseína do leite e os hidrolisados de proteínas de soja), extracto de leveduras, sangue, soro, leite, extracto de solo, etc. Todos estes produtos adicionados ao meio de cultura estimulam a crescimento da maior parte dos microrganismos heterotróficos.



Estado Físico




Líquidos ou caldos

São aqueles que não têm agente solidificante. Não permitem distinguir os diferentes tipos de microrganismos pelo aspecto morfológico porque não há formação de colónias organizadas.

São usados para o estudo da morfologia bacteriana, para aumentar o número de microrganismos e para várias provas bioquímicas (ex. provas fermentativas).

Sólidos

Obtêm-se a partir dos meios de cultura líquidos após adição de uma substância solidificante em determinada quantidade.

Os meios sólidos têm a vantagem de apresentar uma superfície endurecida onde os microrganismos podem crescer, formando colónias. Cada colónia é um aglomerado de células visível macroscopicamente que teve origem a partir da multiplicação de uma só célula e que representa o crescimento de uma só estirpe de microrganismos.

Estes meios permitem observar a morfologia das colónias, isolar culturas puras, conservar e armazenar estirpes bacterianas e observar reacções bioquímicas específicas.

Um meio completamente sólido requer uma concentração de agar entre 1,5 e 2%, enquanto para se obter um meio semi-sólido são necessárias concentrações entre 0,2 e 0,5%.

Semi-sólidos

Obtêm-se também a partir de meios de cultura líquidos após adição de um agente solidificante em menor proporção que nos meios sólidos.

Estes meios de cultura são usados no estudo da mobilidade activa dos microrganismos. Podem também ser usados em estudos fermentativos e na promoção de crescimento anaeróbio.


Agentes solidificantes

Agar ou Gelose:


É o agente solidificante mais utilizado pelos microbiologistas. É um polissacarídeo complexo rico em galactose, mas sem valor nutricional, extraído de algas marinhas. Não é um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não é metabolizado durante o crescimento microbiano.

É um excelente agente solidificante, pois liquefaz-se a cerca de 100º C (o ponto de liquefacção é aos 96º C) mantendo-se nesse estado fundido até aos 42º C quando passa a gel sólido. Assim, os microrganismos, principalmente os patogénicos, podem ser cultivados a 37º C ou a temperaturas ligeiramente mais altas sem o meio de cultura se liquefazer durante a incubação. Por outro lado, como a maior parte dos microrganismos não morre a 45º C, podem ser adicionados ao meio fundido antes deste ser colocado em tubos ou placas de Petri para solidificar. Além de ser possível adicionar aos meios fundidos certas substâncias termolábeis previamente esterilizadas por filtração.

Gelatina:
É obtida a partir de cartilagens e aponevroses de mamíferos. Tem como inconvenientes principais estar liquefeita às temperaturas usadas, geralmente, para incubar os microrganismos patogénicos para o Homem ( 37º C), pois só solidifica aos 22º C, e poder ser digerida por acção dos microrganismos.

Actualmente, está em desuso, sendo só utilizada para estudar microrganismos que actuem sobre ela, ou seja, que possuam a enzima gelatinase (prova da hidrólise da gelatina).

Sílica gel:
É uma substância inorgânica inerte e inatacável por enzimas microbianas. Devido aos seus custos só é usada em trabalhos de grande rigor científico.

Objectivos Funcionais




Simples ou básicos

São os meios que apenas possuem os nutrientes básicos ou essenciais, por isso só crescem microrganismos pouco exigentes que tenham grande capacidade de síntese. Como são meios pobres em nutrientes são insuficientes para suportar o crescimento de microrganismos mais exigentes.


Exemplos:
Água Peptonada: contém água, peptonas e cloreto de sódio.

Ricos ou enriquecidos

A partir dos meios básicos, por adição de outros nutrientes, produzem-se todo o tipo de meios complexos e ricos. Estes meios são usados para a cultura de microrganismos exigentes que têm necessidades nutricionais altamente elaboradas e específicas. Estes microrganismos não crescem ou crescem com dificuldade em meios básicos e por isso requerem a adição de factores de crescimento (são substâncias essenciais para o seu metabolismo, mas que eles não são capazes de sintetizar). Nestes meios pode haver também capacidade de adsorção de substâncias tóxicas.

Estes meios permitem o crescimento generalizado de todos os microrganismos da amostra. Assim, utilizam-se quando se quer quantificar os microrganismos de uma amostra ou se pretende fazer crescer todos os microrganismos que existam num produto que em princípio deveria estar estéril (ex. sangue), já que qualquer crescimento é sinal de patogenicidade.

Um meio rico contém uma grande variedade de substâncias orgânicas como: extracto de carne, extracto de levedura, sangue, soro, líquido ascítico, infusão de coração e cérebro, etc.


Exemplos:
Agar Sangue: é composto por 5 a 10% de sangue desfibrinado, animal ou humano, o que vai enriquecer o meio em nutrientes. O sangue só é adicionado ao meio liquefeito quando a temperatura se encontra entre 45-48º C, para que os glóbulos vermelhos fiquem intactos.

Agar Chocolate: é também composto por sangue, mas este é adicionado ao meio quando a sua temperatura é de 80º C. É utilizado para o crescimento de microrganismos exigentes como os do género Neisseria.

Brain-Heart infusion: é um meio muito rico que contém infusão de cérebro e coração de vitela. É utilizado para microrganismos exigentes como os do género Streptococcus e Neisseria.

Selectivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos)
Além dos nutrientes necessários para o crescimento de todos os microrganismos, estes meios específicos contêm um ou mais compostos químicos que são essenciais devido à sua especificidade funcional.

Estes meios são usados para isolar grupos específicos de microrganismos, pois seleccionam um determinado microrganismo de um produto polimicrobiano (expectoração, fezes, saliva, etc.). No entanto, é preciso ter em conta que não há meios de cultura 100% selectivos, podendo crescer eventualmente outros microrganismos.

São meios que permitem o crescimento de um tipo de microrganismos em detrimento de outro ou de outros, pois são formulados para suprimir o crescimento dos microrganismos que não interessam ao fim em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar. Assim, o favorecimento de um tipo de microrganismo pode dever-se a uma acção inibidora sobre os restantes (condiciona o crescimento de uns) ou à acção estimuladora do microrganismo pretendido (mais raro) ou ambas, ou seja, inibe o crescimento de um tipo de microrganismos enquanto aumenta o crescimento de outro.

Os meios líquidos com inibidores do crescimento microbiano não permitem uma selecção tão precisa como nos meios sólidos, há é um enriquecimento do conteúdo microbiano do meio. Estes caldos estimulam o crescimento de um microrganismo específico, que se torna assim a espécie dominante porque se sobrepõe aos seus competidores. Permitem aumentar a concentração de microrganismos que estão em minoria no ambiente.

Os agentes de selecção podem ser produtos químicos, corantes (eosina, verde de malaquita, azul de metileno, violeta cristal, verde brilhante, etc.), antimicrobianos, sais minerais (tetrationato de sódio, nitrato de potássio, telurito de potássio, cloreto de sódio, etc.), sais biliares, asparagina (promove o crescimento), etc.

Exemplos:



Agar Sabouraud: favorece o crescimento dos fungos, pois tem um pH baixo (5,6) e uma alta concentração de glicose, além disso o crescimento bacteriano está inibido devido à presença de um antibacteriano no meio.

Meio de Löwenstein-Jensen e Meio de Middlebrook: são meios com glicerol e verde de malaquita (corante) que inibem outras bactérias permitindo isolar o Mycobacterium tuberculosis. O primeiro meio contém asparagina que é um favorecedor do crescimento desta espécie bacteriana.

Caldo Verde Brilhante: condiciona o crescimento de cocos Gram positivo e favorece o crescimento de bacilos Gram negativo, principalmente da família Enterobacteriaceae devido à presença de sais biliares e do corante verde brilhante.

Caldo de Tetrationato e Caldo de Selenito: o tetrationato e o selenito de sódio são substâncias inibidoras de bactérias intestinais e de muitos cocos Gram positivo. Estes meios são utilizados no isolamento de Salmonella e de Shigella a partir de produtos (água, alimentos, fezes, urina, etc.) onde a concentração destes patogénicos é baixa em relação ao resto da população normal.

Diferenciais

Estes meios permitem separar grupos de microrganismos através da sua aparência no meio (características morfológicas ou bioquímicas).

Têm incorporado substâncias químicas (indicadores) que, após a inoculação e a incubação, assinalam alterações características na aparência do crescimento microbiano (colónias) e/ou no meio que rodeia as colónias (geralmente por mudança de cor do meio onde existe a colónia) o que permite a sua diferenciação e identificação. Dão informação acerca do comportamento e do metabolismo dos microrganismos, permitindo a visualização de actividades metabólicas.

Um meio com um hidrato de carbono e um indicador de pH permite detectar se o açúcar foi ou não metabolizado, pois este quando fermentado origina como produtos terminais ácidos orgânicos que fazem diminuir o pH e por isso mudam a cor do meio assinalando as características fermentativas do microrganismo em estudo.


Exemplos:


Meio de Simmons: o citrato é neste meio a única fonte de carbono, assim se houver crescimento microbiano significa que o citrato está a ser metabolizado. Isto origina uma variação de pH (aumento de pH) que é detectada pelo azul de bromotimol que passa de verde a azul.

Agar Sangue: este meio com glóbulos vermelhos intactos fornece informação acerca da capacidade hemolítica dos microrganismos. Distingue as bactérias não hemolíticas (gama-hemólise) das bactérias alfa-hemolíticas (hemólise parcial) e das bactérias beta-hemolíticas (hemólise total).

Agar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Media): é um meio diferencial, pois como contém lactose e um indicador de pH (azul de bromotimol) permite detectar se o açúcar foi ou não metabolizado. É usado para cocos Gram positivo e para bacilos Gram negativo, e permite travar o crescimento em toalha dos Proteus.

Simultaneamente selectivos e diferenciais


Exemplos:



Agar MacConkey: é um meio selectivo, pois contém sais biliares e o corante violeta de cristal para inibir o crescimento de bactérias Gram positivo permitindo que as Gram negativo cresçam. Por outro lado, é um meio diferencial, pois como contém lactose e um indicador de pH (vermelho neutro) permite distinguir entre as bactérias Gram negativo que fermentam (ex. E.coli) e as que não fermentam (ex. Salmonella e Shigella) esse hidrato de carbono. As colónias das bactérias fermentadoras de lactose aparecem rosadas enquanto as outras ficam incolores e até transparentes.

Agar Manitol Sal: é um meio selectivo pois, como tem uma grande concentração salina (7,5% NaCl) inibe a maior parte dos microrganismos permitindo o crescimento das bactérias da família Micrococcaceae (cocos Gram positivo). É um meio diferencial, pois tem presente o álcool manitol e um indicador de pH (vermelho de fenol) que passa de vermelho a amarelo se o microrganismo fermentar o manitol.

Agar SS: a presença de sais biliares e do corante verde brilhante tornam-o um meio selectivo, pois inibem muitas bactérias Gram positivo. É bom para o isolamento de Salmonella e Shigella. É um meio diferencial devido à presença de lactose e de um indicador de pH (vermelho neutro) que permite distinguir os microrganismos fermentadores da lactose (colónias rosa) dos não fermentadores (colónias da cor do meio).

Agar EMB (Eosine Methylene Blue) ou Meio de Levine: é um meio selectivo, pois é parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo devido ao azul de metileno, e por conseguinte o crescimento dos Gram negativo é mais abundante. É um meio diferencial, pois a presença de lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactérias fermentadoras das não fermentadoras da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose levam à baixa de pH, de modo que as colónias aparecem com aspecto verde metalizado. Os que não fermentam a lactose produzem colónias incolores, mas devido à sua transparência aparecem com a cor do meio, ou seja, púrpura. Este meio permite identificar os Gram negativo patogénicos através da caracterização visual, porque eles raramente fermentam a lactose.

Meios de transporte

São meios estáveis que não permitem que os microrganismos se desenvolvam, mas mantendo a viabilidade de todos os microrganismos da amostra sem alterarem as suas concentrações.

São usados para armazenamento temporário de amostras para serem transportadas para o laboratório, nas mesmas condições em que se encontravam no momento da colheita.


Meios de manutenção

Permitem manter as culturas durante algum tempo, pois os microrganismos vão crescendo, mas lentamente.

PREPARAÇÃO GERAL DE MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS
Os meios de cultura desidratados são produzidos por Laboratórios comerciais, de tal modo que o nome e a composição de cada meio é praticamente semelhante para todas as marcas. São fornecidos em pó ou em grânulos e a sua preparação faz-se pela simples adição de água destilada, bidestilada ou desionizada (obtido pela acção de resinas troca-iões) em determinada proporção que se encontra expressa no rótulo da embalagem.

Rehidratação


Num recipiente de vidro pesa-se cuidadosamente o pó relativo ao volume que pretendemos obter, segundo as indicações do fabricante. Esses componentes do meio vão ser agora dissolvidos em água destilada, bidestilada ou desionizada, e depois com a ajuda do calor aquece-se até dissolução completa.
Ajuste do pH
Nesta fase pode ser ajustado o pH do meio para valores compatíveis com as bactérias, ou seja, pH  7, que se encontra definido pelo fabricante para cada meio de cultura. Podem-se adicionar soluções tampão (ex. fosfato de sódio ou de potássio) para manter o valor do pH constante.

Em provas fermentativas adicionam-se também os indicadores de pH (ex. vermelho de fenol), caso não façam já parte da composição do meio.


Distribuição
Distribui-se o meio de cultura em quantidades apropriadas por recipientes apropriados (tubos de ensaio, frascos ou balões).
Esterilização
Embora os meios sejam vendidos esterilizados, na fase de rehidratação deixam de o ser e então é necessário esterilizá-los de novo para evitar a presença de microrganismos contaminantes e de outras formas de vida. O método de esterilização utilizado é condicionado pela composição do meio de cultura.

A esterilização dos meios de cultura pode ser feita de vários modos:


* Em autoclave (aplicação do calor húmido sob pressão):
O calor húmido é o método mais efectivo para matar os microrganismos pois causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas, enquanto o calor seco (estufa) causa oxidação dos constituintes orgânicos da célula (isto é os microrganismos vão-se “queimando” lentamente). A desnaturação ocorre com temperaturas inferiores e menor tempo de exposição do que a oxidação (ex. os endósporos de Bacillus anthraccis são destruídos em 2-15 min. pelo calor húmido enquanto com o calor seco demora mais de 180 min. a 140º C para obter o mesmo resultado).

A maneira mais prática de aplicar o calor húmido é através do autoclave, que consiste num sistema fechado de volume constante em que um aumento de pressão permite um aumento de temperatura. O autoclave permite temperaturas altas, um aquecimento mais rápido e uma grande penetração de calor.

É neste aparelho que se esterilizam por rotina os meios de cultura, soluções e materiais contaminados. Normalmente a esterilização dos meios de cultura faz-se por exposição ao vapor a 121º C e 15 lbs de pressão durante 15 minutos ou mais, dependendo do tipo de material a esterilizar.
* Por filtração:
Quando na composição de um meio de cultura entram substâncias que não podem sofrer temperaturas elevadas (ex. gelatina) recorre-se à filtração desses elementos termolábeis.

Utilizam-se filtros de membrana (de celulose), encontrando-se disponíveis uma grande variedade de poros de diferentes dimensões. Geralmente usam-se membranas com poros de 0,2 m de diâmetro que não permitem a passagem dos microrganismos, ficando assim o meio esterilizado.

A filtração é uma excelente maneira de reduzir a população microbiana sem ocorrer destruição directa dos microrganismos, pois o filtro simplesmente os remove.

Acondicionamento


Quando não se pretende usar o meio de cultura de imediato, este deve ser conservado ao abrigo da luz, a uma temperatura entre 0 e 5º C no período determinado pelo fabricante, evitando a sua desidratação. Para o utilizar faz-se a redistribuição para recipientes já esterilizados onde se irão posteriormente semear os microrganismos.

Os meios sólidos para poderem ser redistribuídos tem de ser aquecidos até ficarem liquefeitos, transferidos para um banho de água a 48-50º C para arrefecerem, e finalmente distribuídos por recipientes. Já no recipiente é preciso deixar o meio arrefecer mais para solidificar (Figura 6).

Os meios sólidos no estado liquefeito podem ser colocados em tubos de ensaio (com tampa para evitar a contaminação e a desidratação do meio de cultura) ou em placas de Petri. Para se obter um tubo em rampa deixa-se arrefecer e solidificar o meio de cultura numa posição inclinada, criando assim uma rampa mais ou menos pronunciada. São usados para manter culturas puras. Por outro lado, deixando arrefecer o meio num tubo na posição vertical temos um tubo em cilindro. Estes tubos são usados, por exemplo, para estudar as necessidades em oxigénio dos microrganismos.

Os meios em placa de Petri proporcionam grandes áreas de superfície para o isolamento e o estudo dos microrganismos. As placas de Petri são formadas por duas metades, uma base (que contém o meio de cultura) e uma tampa. Há placas de Petri de vários tamanhos sendo as usadas por rotina de aproximadamente 9 cm de diâmetro.

Os meios líquidos são distribuídos em tubos de ensaio, balões ou frascos também devidamente rolhados.

CULTURA DE MICRORGANISMOS - SEMENTEIRAS

Observação e crítica dos resultados das sementeiras

CARACTERÍSTICAS CULTURAIS DOS MICRORGANISMOS




  • Conhecer procedimentos para a cultura de microrganismos.

  • Compreender a importância das técnicas assépticas na cultura de microrganismos.

  • Conhecer princípios e procedimentos das diversas técnicas de sementeira em placa.

  • Executar sementeiras em diferentes meios de cultura em placa para isolamento de colónias a partir de produtos polimicrobianos.



Texto de Apoio:
Semear é a designação microbiológica para a introdução, num meio de cultura adequado, de um inóculo de origem biológica ou cultural.

Os instrumentos usados para a execução das sementeira são: - ansas simples ou calibradas.

- fio recto.

- pipeta Pasteur.

- vareta de Drigalsky.

- zaragatoa.

- outros
Os meios de cultura sólidos podem ser distribuídos de forma variada de acordo com o que se pretende: em balões tipo Erlermeyer ou outros, tubos em rampa, em cilindro e em placas de Petri.

Os meios de cultura líquidos (caldos) são habitualmente distribuídos em balões ou tubos.

A passagem de bactérias de um meio de cultura para outro é chamada repicagem.

Técnicas de sementeira.

Meios sólidos:

Em picada.

Em estria.

Esgotamento.

Em toalha.

“Shake.”


Meios líquidos:

Dispersão.


O isolamento bacteriano pode ser obtido através de processos:

mecânicos - técnica de sementeira por esgotamento.

biológicos - utilização de meios de cultura selectivos.

Incubação em estufa a 36 - 37º C

Observação do crescimento bacteriano.


Em meios sólidos:
O crescimento traduz-se pelo aparecimento de colónias, isto é, aglomerados de células resultantes da multiplicação bacteriana a partir de um único ancestral.

Nessas colónias devem ser averiguadas as seguintes características, principalmente quando observadas em placas de Petri:


- tamanho – ponta de alfinete, pequeno, médio e grande.

- cor/pigmentação – diversificadas.

- forma - circular, irregular, rizóide e em toalha.

- textura – lisa, rugosa e mucóide.

- brilho – opacas e brilhantes.

- elevação - sem relevo (achatadas), com ligeiro relevo, relevo marcado, convexo e mamilonadas.

- margens – inteiras, lobadas, onduladas, serradas e filamentosas.

Em meios líquidos


O crescimento nos caldos pode ser apreciado por:

- turvação - fina, uniforme, floculenta.



- sedimento.

- película ou anel (crescimento à superfície)

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