Departamento de patologia lucinei roberto de oliveira impacto progn



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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

LUCINEI ROBERTO DE OLIVEIRA


IMPACTO PROGNÓSTICO DA EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO p53 E p63 E O PAPEL DO HPV NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL

Ribeirão Preto

2008
LUCINEI ROBERTO DE OLIVEIRA


IMPACTO PROGNÓSTICO DA EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DO p53 E p63 E O PAPEL DO HPV NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL

Tese apresentada ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas.


Área de Concentração: Patologia Experimental

Orientador: Prof. Dr. Alfredo Ribeiro-Silva

Ribeirão Preto

2008
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.


FICHA CATALOGRÁFICA



Oliveira, Lucinei Roberto

Impacto prognóstico da expressão imunohistoquímica do p53 e p63 e o papel do HPV no carcinoma epidermóide oral. Ribeirão Preto, 2008.

165 p. : il.; 30cm


Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Patologia Experimental.

Orientador: Ribeiro-Silva, Alfredo.


1. Câncer oral. 2. Carcinoma epidermóide oral. 3. Prognóstico. 4. Sobrevida. 5. p53. 6. p63. 7. HPV.

Lucinei Roberto de Oliveira


Título: Impacto prognóstico da expressão imunohistoquímica do p53 e p63 e o papel do HPV no carcinoma epidermóide oral


Tese apresentada ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas.


Área de Concentração: Patologia Experimental
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________Assinatura: __________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________Assinatura: __________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________Assinatura: __________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________Assinatura: __________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________Assinatura: __________________________________

Dedico esta Tese aos meus pais,

Luciano Rosa de Oliveira e Ana Maria de Oliveira

AGRADECIMENTOS
Ao meu amigo e orientador, Prof.Dr. Alfredo Ribeiro-Silva, pela agradável convivência, pelas sugestões e pela oportunidade de contínuo aprendizado e desenvolvimento científico ao seu lado.

Ao meu amigo e co-orientador, Prof.Dr. Sergio Zucoloto, pelos ensinamentos, estímulos, oportunidade, generosidade, confiança e constante disponibilidade em ajudar. Um ser humano excepcional e uma pessoa rara de se encontrar.

Aos membros titulares da Comissão Julgadora, Profa.Dra. Albina Messias de Almeida Milani Altemani, Prof.Dr. Luiz Guilherme Brentegani, Profa.Dra. Suzie Aparecida de Lacerda e Prof.Dr. Sergio Zucoloto, pela atenção, simpatia e disponibilidade em avaliar este trabalho, conferindo e valorizando o mérito científico de todo o nosso esforço.

À Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, na pessoa de seu diretor, Prof.Dr. Marcos Felipe Silva de Sá.

Ao Presidente da Comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Prof.Dr. Julio Sérgio Marchini.

Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental do Departamento de Patologia da FMRP/USP, Prof.Dr. Sérgio Britto Garcia, pela oportunidade, colaboração e confiança.

Aos funcionários do Departamento de Patologia da FMRP – USP, especialmente as secretárias Neide, Rosângela, Renata, Camila e Edna Pio (in memorian), além da amizade, pela constante e simpática presença, auxiliando na resolução das partes burocráticas da Pós-Graduação.

Às funcionárias, Deisy Mara da Silva, Márcia Aparecida Ferreira Oliva e Laura Midori Kawasse, pela amizade e ótima convivência, assim como também pela imprescindível e excelente assistência técnica para a execução do presente trabalho.

À CAPES, FAEPA, FAPESP e Pró-Reitoria de Pós-Graduação da USP, pelo apoio financeiro concedido.

Aos colegas da Pós-Graduação, pela amizade e pelas experiências compartilhadas.

Ao Prof.Dr. Aguinaldo Luiz Simões, pela oportunidade de utilização e aprendizado em seu laboratório (Laboratório de Genética Bioquímica do Depto. de Genética da FMRP), além da disponibilidade e do auxílio para a melhoria da redação do trabalho publicado.

Às amigas e técnicas do Laboratório de Genética Bioquímica do Depto. de Genética da FMRP, Ana Lúcia, Maria do Carmo, Cláudia, Juliana e Elisabete, pelos ensinamentos, pela ajuda e paciência durante uma importante fase do estudo.

Aos funcionários responsáveis pelo arquivo do Depto. de Patologia no HC da FMRP, Décio Barrionovo e César Augusto Junior; além da amizade, por fazerem agradáveis e divertidos os momentos de trabalho por lá.

Ao Prof.Dr. Miguel Angel Sala Di Matteo, pela ajuda na análise estatística do trabalho.

Aos funcionários do Serviço de Arquivo Médico (SAME) do HC da FMRP, pelo valioso auxílio prestado durante a investigação dos prontuários médicos dos pacientes.

À minha namorada, Andrielle de Castilho Fernandes, pelo apoio, carinho, estímulo, ajuda, conselhos, compreensão, paciência e por tudo aquilo mais que eventualmente eu tenha esquecido de mencionar aqui.

Agradeço, enfim, a toda minha família, pelo apoio incondicional e permanente.

A ESTALAGEM DA RAZÃO

A meio caminho entre a fé e a crítica está a estalagem da razão. A razão é a fé no que se pode compreender sem fé; mas é uma fé ainda, porque compreender envolve pressupor que há qualquer coisa compreensível.
Trecho 176

Fernando Pessoa – Livro do Desassossego

Este trabalho contou com os seguintes apoios financeiros:

- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – Processo n° 03/02532-8).


- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Processo n° 476714/2004-4).
- Coordenação de Aperfeiçoamento do Ensino Superior (CAPES).
- Fundação de Assistência ao Ensino e Pesquisa (FAEPA) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
- Pró-Reitoria de Pós-Graduação da Universidade de São Paulo.

Este trabalho resultou nas seguintes publicações:



1- Oliveira LR, Ribeiro-Silva A, Zucoloto S. Perfil da incidência e da sobrevida de pacientes com carcinoma epidermóide oral em uma população brasileira. J Bras Patol Med Lab. 42(5): 385-92, 2006.
2- Oliveira LR, Ribeiro-Silva A, Zucoloto S. Prognostic impact of p53 and p63 immunoexpression in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med. 36(4): 191–7, 2007.
3- Oliveira LR, Ribeiro-Silva A, Zucoloto S. Prognostic significance of p53 and p63 immunolocalisation in primary and matched lymph node metastasis in oral squamous cell carcinoma. Acta Histochem. 109(5): 388-96, 2007.
4- Oliveira LR, Ribeiro-Silva A, Ramalho LNZ, Simões AL, Zucoloto S. HPV infection in Brazilian oral squamous cell carcinoma patients and its correlation with clinicopathological outcomes. Mol Med Rep. 1: 123-9, 2008.


RESUMO
OLIVEIRA, L. R. Impacto prognóstico da expressão imunohistoquímica do p53 e p63 e o papel do HPV no carcinoma epidermóide oral. 2008. 165f. Tese (Doutorado em Patologia Experimental) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil.
O Brasil está entre os países com os maiores índices de carcinoma epidermóide oral (CEO). O gene p63 é um análogo do supressor tumoral p53 e a influência da expressão de ambos no prognóstico do CEO ainda necessita ser melhor investigada. O envolvimento do papilomavírus humano (HPV) no CEO é outro fator ainda não elucidado. Nosso estudo objetivou avaliar os pacientes com CEO no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, assim como também investigar a relação entre a presença do HPV e a imunoexpressão das proteínas p53 e p63 com alguns parâmetros relevantes ao prognóstico deste tumor. Os seguintes dados foram obtidos dos prontuários médicos de 424 pacientes: idade, gênero, localização e tamanho da lesão primária, história pregressa, consumo de tabaco e álcool, exposição actínica, traumatismo por prótese, recidivas, metástases, diferenciação tumoral, tratamento, sobrevida e óbitos. Cento e vinte e seis pacientes foram selecionados para o estudo da sobrevida, 106 para o estudo imunohistoquímico, 45 para a investigação IHQ com amostras pareadas (AP) e 87 para a reação em cadeia da polimerase para detecção do HPV e análise multivariada. Os tumores tiveram predominância em pacientes masculinos na 6ª década de vida, havendo após esta faixa etária um aumento dos casos no gênero feminino e menor sobrevida. A língua foi a região mais acometida, e as lesões em lábio inferior demonstraram maior atraso na procura pelo tratamento e relatos de exposição actínica desprotegida. As recidivas ocorreram em 30% dos pacientes, 28,8% tiveram metástases e 13,2% foram a óbito. Os tumores bem diferenciados foram predominantes (47,7%), e a sobrevida livre da doença (SLD) e a sobrevida global (SG) em cinco anos foram 19% e 24,3%, respectivamente. A imunoexpressão de p63 (87,8%) nos tumores foi maior que a de p53 (52,8%), mas os tumores p53 positivos estiveram significativamente associados aos casos de metástases. Os tumores p53 negativos e com forte intensidade de imunoexpressão de p63 demonstraram melhor SG. No estudo com AP, os tumores com elevada imunoexpressão de p63 demonstraram melhor sobrevida e as neoplasias p53 negativas tiveram melhor SLD. A maioria dos casos demonstrou um padrão concordante de imunoexpressão nas AP (73,3% para p53 e 53,3% para p63, respectivamente). O HPV foi encontrado em 18 (10,4%) amostras de CEO, correspondendo a 17 (19,5%) pacientes. Foram encontradas amostras positivas em 10 (11,5%) tumores primários e em 8 (9,2%) AP. Foram identificados os subtipos de HPV 16 e 18 em 4 (22,2%) e 3 (16,7%) das amostras positivas, respectivamente. Em 6 (33,3%) amostras foi encontrada a presença de ambos os subtipos e em 5 (27,8%) amostras não foi identificado. As amostras HPV positivas foram significativamente associadas aos pacientes não fumantes. Diferenças significativas relacionadas ao prognóstico do CEO na análise multivariada foram encontradas para idade, localização tumoral e p53. A imunoexpressão de p53 e a baixa intensidade da imunoexpressão de p63 demonstraram relação com pior prognóstico. Uma associação do HPV à carcinogênese oral foi observada nos pacientes não fumantes.

Palavras-chave: câncer oral, carcinoma epidermóide oral, prognóstico, sobrevida, p53, p63, HPV.
ABSTRACT
OLIVEIRA, L. R. Prognostic impact of p53 and p63 immunoexpression and the HPV role in oral squamous cell carcinoma. 2008. 165p. Thesis (PhD in Experimental Patology) – Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, Brazil.
Brazil is among the countries with the largest indexes of oral squamous cell carcinoma (OSCC). The role of p53 and p63 in the OSCC prognosis is still debatable. The involvement of the human papilomavirus (HPV) in CEO is still another factor no elucidated. Our study aimed to evaluate the patients with OSCC diagnosed in the Teaching Hospital of the Ribeirao Preto Medical School of the Sao Paulo University, as well as to investigate the relationship between the p53 and p63 proteins immunoexpression and the HPV presence with some relevant clinicopathological parameters to the tumor prognostic. The data obtained from the medical files of 424 patients were: age, gender, primary tumor (PT) site and size, evolution time, tobacco and alcohol consumption, actinic radiation exposition, prosthesis trauma reports, recurrences, metastases, tumoral differentiation, treatment, survival and deaths. One hundred twenty-six patients were selected for the survival study, 106 for the immunohistochemical investigation, 45 for the IHQ analysis with matched samples (MS), and 87 for the polymerase chain reaction test of HPV and multivariate analysis. Tumors were prevalent in masculine patients around the 6th decade of life, with an increase in feminine gender and a smaller survival after this age. Tongue was the prevalent site, and the lower lip lesions had the larger delay to look for treatment and high reports of unprotected actinic exposition. There were recurrences in 30% of the patients, 28.8% had metastases and 13.2% died. Well differentiated tumors were more prevalent in this study (47.7%), and the five years disease free survival (DFS) and overall survival (OS) were 19% and 24.3%, respectively. The p63 immunoexpression (87.8%) in tumors was higher than p53 (52.8%), and the p53 positive tumors were significantly associated with metastases. The p53 negative tumors and those with strong p63 immunoexpression intensity demonstrated better OS. In the MS study, tumors with high p63 immunoexpression demonstrated better survival and those p53 negative had better DFS. Most of cases demonstrated a concordant immunoexpression pattern in MS (73.3% for p53 and 53.3% for p63, respectively). HPV was found in 18 (10.4%) OSCC samples, corresponding to 17 (19.5%) patients. There were positive samples in 10 (11.5%) PT and 8 (9.2%) MS. The subtypes HPV 16 and 18 were identified in 4 (22.2%) and 3 (16.7%) of the positive samples, respectively. Presence of both subtypes was found in 6 (33.3%) samples and in 5 (27.8%) samples they were not identified. The HPV positive samples were significantly associated with non-smoker patients. Significant differences related to the OSCC prognostic were found in multivariate analysis for age, tumoral site and p53. The p53 immunoexpression and low intensity of p63 immunoexpression demonstrated relation with worse prognostic, and a HPV association to oral carcinogenesis was verified in the non-smoker patients.

Keywords: oral cancer, oral squamous cell carcinoma, prognostic, survival, p53, p63, HPV.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP - Amostras Pareadas

AgNO3 - Nitrato de Prata

AIS - Amplified In Squamous carcinoma

AJCC - American Joint Committee on Cancer

BSA - Bovine Serum Albumin solution

CEO - Carcinoma Epidermóide Oral

CID - Código Internacional de Doenças

DAB - Diamino-Benzidina

DBD - DNA Binding Domain

DNA - Desoxyribonucleic Acid

E - Early genes

EEC - Ectrodactyly, Ectodermal dysplasia and facial Clefts

HC/FMRP - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

HPV - Human Papillomavírus

HSP - Heat Shock Protein

IARC - International Agency for Research on Cancer

IC - Intervalo de Confiança

INCA - Instituto Nacional de Câncer

L - Late genes

LCR - Long Control Region

ML - Metástase Linfonodal

OD - Oligomerization Domain

OMS - Organização Mundial da Saúde

OR - Odds Ratio

ORF - Open Reading Frame

pb - Pares de Base

PBS - Phosphate-Buffered Saline

PCR - Polymerase Chain Reaction

SAM - Sterile Alpha Motif

SAME - Serviço de Arquivo Médico

SG - Sobrevida Global

SLD - Sobrevida Livre da Doença

TA - Transactivation Domain

TBE - Tris-ácido Bórico-EDTA

TEMED - Tetrametiletilenodiamina

TNM - Tumor-Nódulo-Metástase

TP - Tumor Primário

UICC - União Internacional Contra o Câncer

USA - United States of America

USP - Universidade de São Paulo



LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Isoformas da proteína p63 (A) e porcentagem de homologia seqüencial de seus domínios funcionais com p53 (B) 44

Figura 2 – História pregressa da evolução dos tumores primários até a procura do serviço pelos pacientes (N = 398) 84

Figura 3 – História pregressa das lesões conforme a localização anatômica tumoral primária 84

Figura 4 – Relatos de exposição actínica desprotegida nos 70 pacientes com diagnóstico de carcinoma epidermóide em lábio inferior 85

Figura 5 – Sobrevida global dos pacientes estudados 87

Figura 6 – Sobrevida dos pacientes com recidivas, metástases, recidivas e metástases ou ausência de ambos 87

Figura 7 – Sobrevida dos pacientes classificados conforme a idade 88

Figura 8 – Sobrevida dos pacientes conforme as quatro localizações anatômicas tumorais primárias de maior prevalência 88

Figura 9 – Fotomicrografia de células tumorais positivas para a proteína p63 (marcação nuclear escura, imunohistoquímica, x40) 90

Figura 10 – Fotomicrografia de células tumorais positivas para a proteína p53 (marcação nuclear escura, imunohistoquímica, x40) 90

Figura 11 – Análise das curvas de sobrevida livre da doença conforme a imunoexpressão quantitativa da proteína p63 94

Figura 12 – Análise das curvas de sobrevida global conforme a imunoexpressão quantitativa da proteína p63 94

Figura 13 – Análise das curvas de sobrevida livre da doença conforme a intensidade de imunoexpressão da proteína p63 95

Figura 14 – Análise das curvas de sobrevida global conforme a intensidade de imunoexpressão da proteína p63 95

Figura 15 – Análise das curvas de sobrevida livre da doença conforme a imunoexpressão da proteína p53 96

Figura 16 – Análise das curvas de sobrevida global conforme a imunoexpressão da proteína p53 96

Figura 17 – Comparação das curvas da sobrevida global nos pacientes estudados conforme o padrão de imunoexpressão de p63 no tumor primário e em sua respectiva metástase linfonodal 100

Figura 18 – Comparação das curvas da sobrevida livre da doença nos pacientes estudados conforme o padrão de imunoexpressão de p63 no tumor primário e em sua respectiva metástase linfonodal 100

Figura 19 – Comparação das curvas da sobrevida livre da doença nos pacientes estudados conforme o padrão de imunoexpressão de p53 no tumor primário e em sua respectiva metástase linfonodal 101

Figura 20 – Comparação das curvas da sobrevida global nos pacientes estudados conforme o padrão de imunoexpressão de p53 no tumor primário e em sua respectiva metástase linfonodal 101

Figura 21 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% dos produtos da amplificação do DNA genômico para detecção do gene da beta-globina e do DNA do HPV 106

Figura 22 – Distribuição dos pacientes com carcinoma epidermóide oral avaliados conforme o gênero e a presença do DNA do HPV 104

Figura 23 – Distribuição dos pacientes com carcinoma epidermóide oral avaliados conforme a idade e a presença do DNA do HPV 105

Figura 24 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% dos produtos da amplificação do DNA genômico para detecção e tipificação do DNA do HPV 106

Figura 25 – Sobrevida livre da doença dos pacientes com carcinoma epidermóide oral avaliados conforme a presença ou ausência do DNA do HPV 107

Figura 26 – Sobrevida global dos pacientes com carcinoma epidermóide oral avaliados conforme a presença ou ausência do DNA do HPV 108



LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características das regiões regulatórias (ORFs) do HPV 53

Tabela 2 – Características clinicopatológicas dos 424 pacientes com carcinoma epidermóide oral investigados conforme a localização tumoral anatômica primária (%) 81

Tabela 3 – Distribuição dos pacientes estudados conforme o tamanho e a localização do tumor primário no momento da biópsia inicial (%) 82

Tabela 4 – Distribuição do número e porcentagem de pacientes segundo a idade e o gênero 82

Tabela 5 – Distribuição dos pacientes com ocorrência de metástases à distância conforme a localização anatômica primária e os órgãos afetados (%) 83

Tabela 6 – Características clinicopatológicas dos 126 pacientes com carcinoma epidermóide oral selecionados para o estudo da sobrevida (%) 86

Tabela 7 – Características clinicopatológicas dos pacientes selecionados para o estudo imunohistoquímico (%) 89

Tabela 8 – Distribuição quantitativa da imunoexpressão da proteína p63 associada com o padrão de diferenciação tumoral e com os episódios de recidivas e metástases (%) 91

Tabela 9 – Distribuição da intensidade da imunoexpressão da proteína p63 associada com o padrão de diferenciação tumoral e com os episódios de recidivas e metástases (%) 92

Tabela 10 – Distribuição da imunoexpressão da proteína p53 associada com o padrão de diferenciação tumoral e com os episódios de recidivas e metástases (%) 92

Tabela 11 – Associação entre a imunoexpressão das proteínas p53 e p63 nos casos estudados 93

Tabela 12 – Características demográficas e clinicopatológicas dos pacientes com carcinoma epidermóide oral selecionados para o estudo com amostras pareadas 97

Tabela 13 – Grau de diferenciação histológico tumoral em todas as amostras estudadas agrupados conforme os resultados de imunoexpressão das proteínas p53 e p63 (%) 98

Tabela 14 – Resultados dos padrões de imunoexpressão dos tumores primários comparados com suas respectivas metástases linfonodais, demonstrando a concordância ou discordância nos 45 pacientes avaliados (%) 99

Tabela 15 – Características clinicopatológicas dos pacientes com carcinoma epidermóide oral selecionados para o estudo de detecção do HPV 102

Tabela 16 – Características clinicopatológicas dos 17 pacientes diagnosticados com carcinoma epidermóide oral e com positividade para o DNA do HPV 103

Tabela 17 – Distribuição dos pacientes com carcinoma epidermóide oral avaliados conforme o grau de diferenciação histológico e a presença do DNA do HPV (%) 104

Tabela 18 – Presença do DNA do HPV nos pacientes com carcinoma epidermóide oral conforme o consumo de tabaco (%) 105

Tabela 19 – Sobrevida global acumulada nos 87 pacientes com carcinoma epidermóide oral conforme as variáveis investigadas 109

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 21

2. REVISÃO DA LITERATURA 22

2.1 Câncer oral 22

2.1.1 Epidemiologia do carcinoma epidermóide oral 24

2.1.2 Etiologia do carcinoma epidermóide oral 25

2.1.3 Características clínicas 27

2.1.4 Características histopatológicas 31

2.1.5 Tratamento 33

2.1.6 Prognóstico do carcinoma epidermóide oral 34

2.2 Marcadores imunohistoquímicos 37

2.2.1 O gene p53 38

2.2.2 Função do gene p53 39

2.2.3 Expressão da proteína p53 no carcinoma epoidermóide oral 41

2.3.1 O gene p63 43

2.3.2 Estrutura e função do gene p63 43

2.3.3 O gene p63 na proliferação e diferenciação celular 47

2.3.4 Influência do gene p63 nas neoplasias 48

2.3.5 Expressão da proteína p63 no carcinoma epidermóide oral 50

2.4 O Papilomavírus Humano (HPV – Human Papillomavirus) 51

2.4.1 Mecanismos moleculares de transformação maligna do HPV 54

2.4.2 Detecção do HPV na cavidade oral 57

2.4.3 Transmissão do HPV para a mucosa oral 61

2.4.4 Detecção do HPV por PCR em amostras parafinizadas de carcinoma

epidermóide oral 62

3. OBJETIVOS 65

4. MATERIAL E MÉTODOS 66

4.1 Aspectos éticos 66

4.2 Casuística 66

4.3 Critérios e definições 67

4.4 Estudo da sobrevida 69

4.5 Estudo imunohistoquímico 69

4.6 Estudo imunohistoquímico com amostras pareadas 71

4.7 Detecção do HPV no carcinoma epidermóide oral 72

4.7.1 Extração do DNA em amostras parafinizadas 73

4.7.2 Reação em cadeia da polimerase 73

4.7.3 Amplificação e tipificação do HPV 75

4.7.4 Separação eletroforética e análise do produto amplificado 76

4.8 Análises estatísticas 78

4.9 Reagentes e soluções 78



5. RESULTADOS 79

5.1 Estudo da sobrevida 85

5.2 Estudo imunohistoquímico 88

5.3 Estudo imunohistoquímico com amostras pareadas 97

5.4 Detecção do HPV no carcinoma epidermóide oral 102

5.5 Análise multivariada dos fatores clinicopatológicos e moleculares associados ao prognóstico dos pacientes com carcinoma epidermóide oral 108



6. DISCUSSÃO 110

7. CONCLUSÕES 131

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 133

9. ANEXOS 153

ANEXO A. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa 153

ANEXO B. Protocolo de Imunohistoquímica 154

ANEXO C. Reagentes e Soluções de Imunohistoquímica 157

ANEXO D. Protocolo para extração e purificação do DNA genômico das amostras teciduais parafinizadas com o kit Magnesil Tissue System® – Promega 160

ANEXO E. Reagentes e soluções para PCR 164



1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma das principais causas de óbito em todo o mundo, sendo superado apenas pelas doenças cardiovasculares nos países desenvolvidos. Para as próximas décadas, já é esperado o dobro do número de pessoas diagnosticadas com câncer, aumentando a demanda por novos métodos diagnósticos e terapêuticos (DE MEJIA et al. 2003).

O carcinoma epidermóide oral (CEO) é a neoplasia oral maligna mais freqüente, correspondendo a cerca de 95% dos tumores orais (FORASTIERE et al., 2001). Caracteriza-se como uma doença de características heterogêneas, com padrões distintos de apresentação e comportamento. Por estes motivos, ainda não foi esclarecido porque alguns pacientes com o mesmo estadiamento tumoral e localização anatômica primária evoluem melhor do que outros.

Por sua elevada letalidade e pelas possibilidades de identificação precoce por parte da rede básica de atendimento odontológico, os pacientes acometidos pelo CEO representam um sério problema de saúde pública mundial, com maior tendência de crescimento nos países em desenvolvimento (SANKARANARAYANAN et al., 1998). Além disso, tem predomínio no gênero masculino, assim como também nos pacientes por volta da sexta década de vida. No entanto, tem sido observado um aumento na incidência em adultos jovens, assim como em pacientes do gênero feminino. As regiões anatômicas mais afetadas são a língua, o assoalho oral e o lábio inferior (GERVASIO et al., 2001).

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Câncer oral

As neoplasias malignas da mucosa oral representam cerca de 10% dos tumores malignos que ocorrem no corpo humano, sendo o câncer oral o 6º tipo de câncer mais prevalecente no mundo (CARVALHO, 2003; PARKIN et al., 2005). Pelo menos 95% das neoplasias orais consistem em carcinomas epidermóides, e os tumores adicionais compreendem os glandulares, os melanomas, os sarcomas e os odontogênicos. Excluindo-se o câncer de pele, o CEO pode ser considerado o mais comum da região de cabeça e pescoço (38% dos casos), predomina no gênero masculino e tem 75% dos casos diagnosticados na faixa etária dos 60 anos (COSTA ADE et al., 2002; PARKIN et al., 2005; WUNSCH-FILHO, 2002). Segundo Gervásio et al. (2001), o CEO pode ser considerado uma neoplasia da terceira idade, sendo visto esporadicamente antes da terceira e quarta década de vida.

O termo câncer oral integra na Classificação Internacional de Doenças (CID) da OMS o grupo compreendido nos seguintes códigos: C00 – Neoplasia maligna do lábio, C02 – Neoplasia maligna dos dois terços anteriores da língua, C03 – Neoplasia maligna da gengiva, C04 – Neoplasia maligna do assoalho da boca, C05 – Neoplasia maligna do palato duro, C06 – Neoplasia maligna de outras partes e de partes não especificadas da boca e C06-2 – Neoplasia maligna da área retromolar (CID-10, 1997). Para o estudo do CEO, é de fundamental importância a distinção da região da orofaringe, que inclui palato mole, base da língua, região tonsilar e faringe posterior, onde as características clínicas, o prognóstico da lesão e a sensibilidade à radioterapia são distintos. No entanto, a maioria dos estudos envolvendo lesões orais não separa as regiões anatômicas orais específicas (HA; CALIFANO, 2004; ORD, 1996). Em um artigo sobre prevenção do CEO, o próprio Instituto Nacional de Câncer (INCA) incluiu as patologias malignas das glândulas salivares, tonsilas e orofaringe como áreas anatômicas associadas à denominação de “câncer de boca” (BRASIL, 2003).

O CEO é caracterizado como um tumor epitelial agressivo, pois apesar dos avanços terapêuticos utilizando os mais recentes protocolos cirúrgicos, radioterápicos e/ou quimioterápicos, a sobrevida dos pacientes em longo prazo permaneceu menor que 50% nos últimos 50 anos. Entre as principais causas para este prognóstico ruim está o atraso no diagnóstico da doença, sendo que geralmente o tumor é detectado quando já alcançou um estágio avançado (FORASTIERE et al., 2001).

Alguns trabalhos demonstram prognóstico ruim e taxas de sobrevida reduzidas nas populações de baixos níveis sócio-econômicos e que geralmente consomem álcool e tabaco em excesso, pois estes pacientes tendem a demorar mais para procurar cuidados profissionais (MACFARLANE et al., 1996; WUNSCH-FILHO, 2002). Desta forma, em um estudo comparando pacientes com CEO entre instituições de um país desenvolvido e de um país em desenvolvimento, foi encontrada menor sobrevida para os pacientes desta última (CARVALHO et al., 2004).

Dependendo da extensão da lesão primária e da localização anatômica específica, o CEO demonstra grande predisposição para a disseminação de metástases em linfonodos cervicais. Na prática clínica, o planejamento terapêutico e o prognóstico dos pacientes com CEO estão orientados principalmente pelo estadiamento clínico da lesão, seguindo a classificação TNM (Tumor-Nódulo-Metástase), onde o T representa o tamanho do tumor primário (maior diâmetro da lesão), o N representa a disseminação linfática regional pelo tumor e o M significa presença de doença metastática à distância (SOBIN; WITTEKIND, 2002). No entanto, o sistema TNM possui informações insuficientes sobre as características biológicas tumorais, sendo estas informações de fundamental importância para a obtenção de novos fatores prognósticos que possam providenciar informações mais acuradas sobre a agressividade deste tipo de tumor (HIRATSUKA et al., 1997).


2.1.1 Epidemiologia do carcinoma epidermóide oral

Estudos epidemiológicos demonstram que a prevalência do câncer oral varia significativamente entre os continentes, assim como também dentro de cada país, estando esta variação possivelmente relacionada com as diferenças locais de incidência dos fatores de risco (JOVANOVIC et al., 1993).

De acordo com as estatísticas de câncer mundiais, em 2002, aproximadamente 274.000 novos casos de câncer oral foram diagnosticados, cerca de 128.000 pacientes foram a óbito por este tipo de neoplasia maligna e quase dois terços dos casos foram diagnosticados no gênero masculino. A região geográfica com maior taxa bruta de incidência é a Melanésia (31,5 casos por 100.000 homens e 20,2 casos por 100.000 mulheres), seguida pelo Sul da Ásia (12,7 casos por 100.000 homens e 8,3 casos por 100.000 mulheres) e também pela alta incidência no gênero masculino no Oeste e Sul da Europa (11,3 e 9,2 casos por 100.000, respectivamente). Os padrões de incidência refletem a influência regional de fatores de risco específicos, como o alto consumo de tabaco e álcool em países do Oeste e Sul europeu, assim como o freqüente hábito de mascar folhas de betel na Melanésia e no Sul asiático (PARKIN et al., 2005). Como agravante, a folha de betel não é utilizada sozinha, sendo enrolada em conjunto com outros ingredientes, como noz de betel, cal extinta e tabaco (KAUGARS et al., 1992).

Devido ao crescente uso do tabaco, a tendência atual da incidência do câncer oral vem aumentando no gênero feminino (CARVALHO et al., 2001). Além disso, ainda não é compreendido o motivo pelo qual a incidência desta doença também é crescente em indivíduos com idade abaixo dos 40 anos e desprovidos de exposição a qualquer fator de risco reconhecido (LINGEN et al., 2000; SCHANTZ; YU, 2002).

O Brasil está entre os países que possuem os maiores índices de câncer oral. Segundo dados do INCA, as taxas de prevalência, incidência e mortalidade para o câncer oral em algumas áreas no Brasil estão entre as mais altas do mundo, sendo a região de maior prevalência a Sudeste, seguida da região Sul. O câncer oral representa o 8º tipo de câncer mais freqüente, sendo a 6ª neoplasia maligna mais comum do gênero masculino e a 8ª do feminino. Para o ano de 2006, as estimativas do INCA indicaram cerca de 13.470 novos casos, com 10.060 casos acometendo o gênero masculino e 3.410 o feminino, sendo 60% deles na região Sudeste (BRASIL, 2006).

O estado de São Paulo é considerado uma região endêmica para o câncer oral, porque possui uma das maiores taxas brutas de incidência no país para cada 100.000 habitantes, sendo de 17,20 e 4,17 para o gênero masculino e feminino, respectivamente. Além disso, concentra 32% e trata cerca de 42% de todos os casos do país (BRASIL, 2006). A cidade de São Paulo, possui a maior taxa bruta de incidência para cada 100.000 habitantes do continente americano, com 19,45 e 5,05 para o gênero masculino e feminino, respectivamente (BRASIL, 2006; WUNSCH-FILHO, 2002). Devido a estes altos números, através do Projeto de Lei 703/05 (30/09/2005), ficou instituída a "Semana Estadual de Prevenção e Combate ao Câncer Oral", que ocorre anualmente de 24 a 31/05, no estado de São Paulo.






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