Divisão de Biologia Médica



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LABORATÓRIO DE SAÚDE PÚBLICA DR. GIOVANNI CYSNEIROS

MANUAL PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE NO ESTADO DE GOIÁS

2ª VERSÃO – OUTUBRO DE 2014





LABORATÓRIO DE SAÚDE PÚBLICA DR. GIOVANNI CYSNEIROS

MANUAL PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE NO ESTADO DE GOIÁS.

Goiânia – Outubro de 2014

2ª versão

LABORATÓRIO DE SAÚDE PÚBLICA DR. GIOVANNI CYSNEIROS


EQUIPE RESPONSÁVEL PELA ELABORAÇÃO

CARMEN HELENA RAMOS



Área de Biologia Médica
VINICIUS LEMES DA SILVA

Laboratório de Virologia
MAYSA MADALENA DE JESUS SILVA

Bancada de Sorologia da Dengue e Febre Amarela/VIROLOGIA
LUCILEIS DE FÁTIMA FERNANDES DA SILVA

Bancada de Isolamento Viral/VIROLOGIA
ÂNGELA FERREIRA LOPES DE TEIVE E ARGOLO

Bancada de Soroneutralização/VIROLOGIA
LUIZ AUGUSTO PEREIRA

Laboratório de Biologia Molecular

2ª versão, outubro de 2014 – revisores:

Angela Ferreira Lopes de Teive e Argolo

Lucileis de Fátima Fernandes da Silva

Luiz Augusto Pereira

Márcia Tomaz Freire

Maysa Madalena de Jesus Silva

Vinicius Lemes da Silva
Aprovação:

Carmen Helena Ramos

SUMÁRIO



  1. DEFINIÇÃO DE CASO 02

  2. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE NO LACEN-GO 03

  3. PESQUISA DE IgM PARA DENGUE 03

    1. Quando realizar a sorologia IgM

    2. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o diagnóstico sorológico - IgM

    3. Avaliação da Qualidade do Diagnóstico em Dengue (AQDD) – Sorologia IgM

    4. Encaminhamento de amostras para exame confirmatório

  4. PESQUISA DO ANTÍGENO NS1 (NS1Ag) 06

    1. Quando realizar a sorologia para detecção do antígeno NS1

    2. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o diagnóstico sorológico NS1

  5. DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO – ISOLAMENTO VIRAL 08

    1. Quando realizar o isolamento viral

    2. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o isolamento viral

    3. Cotas mensais de envio de amostras para o isolamento viral de dengue

  6. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DENGUE POR BIOLOGIA MOLECULAR / RT-PCR 11

    1. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras biológicas para realização do teste de RT-PCR para dengue

    2. Orientação para rotulagem e envio de amostras ao LACEN/GO – RT-PCR

    3. Realização do diagnóstico molecular para dengue

  7. DIAGNÓSTICO EM CASOS DE ÓBITO COM SUSPEITA DE DENGUE 14

    1. Instruções para coleta de amostras em situação de óbito

  8. FLUXO DE RESULTADOS 16




  1. BIBLIOGRAFIA 17




  1. ANEXOS 18




    1. FORMULÁRIO DE AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DIAGNÓSTICO EM DENGUE – SOROLOGIA IgM;

    2. FIXA DE ENCAMINHAMENTO PARA REALIZAÇÃO DE EXAME CONFIRMATÓRIO;

    3. FLUXO DE EXAMES PARA DENGUE – LACEN/GO;

    4. FLUXO DE EXAMES EM CASO DE ÓBITO SUSPEITO POR DENGUE - LACEN/GO

  1. DEFINIÇÃO DE CASOS

A partir de janeiro de 2014 o Ministério da Saúde (MS), seguindo recomendações da Organização Mundial de Saúde (OMS) passa a adotar, segundo os critérios clínicos e laboratoriais, as seguintes definições para este agravo: dengue, dengue com sinais de alarme e dengue grave.



Caso suspeito de dengue: pessoa que viva ou tenha viajado nos últimos 14 dias para área onde esteja ocorrendo transmissão de dengue ou que tenha a presença de Ae. aegypti, que apresente febre (usualmente entre 2 e 7 dias), além de apresentar duas ou mais das seguintes manifestações: náuseas, vômitos, exantema, mialgia, artralgia, cefaléia, dor retro-orbital, petéquias ou prova do laço positiva e leucopenia. Considera-se também como caso suspeito toda criança proveniente ou residente em área com transmissão de dengue, com quadro febril agudo, usualmente entre 2 a 7dias, e sem foco de infecção aparente.
Caso suspeito de dengue com sinais de alarme: todo caso de dengue que, no período de efervescência da febre apresentar um ou mais dos seguintes sinais de alarme: dor abdominal intensa e contínua ou dor a palpação do abdômen, vômitos persistentes, acumulação de líquidos (ascites, derrame pleural, pericárdico), sangramento de mucosas, letargia ou irritabilidade, hipotensão postural (lipotimia), hepatomegalia maior que dois centímetros e aumento progressivo do hematócrito.
Caso suspeito de dengue grave: todo caso de dengue que apresenta um ou mais dos seguintes resultados abaixo:

• Choque devido ao extravasamento grave de plasma evidenciado por taquicardia, extremidades frias e tempo de enchimento capilar igual ou maior a três segundos, pulso débil ou indetectável, pressão diferencial convergente menor ou igual a 20mmHg, hipotensão arterial em fase tardia, acumulação de líquidos com insuficiência respiratória;

• Sangramento grave, segundo avaliação do médico (exemplos: hematêmese, melena, metrorragia volumosa, sangramento do sistema nervoso central);

• Comprometimento grave de órgãos tais como: dano hepático importante (AST o ALT >1000), sistema nervoso central (alteração da consciência), coração (miocardite) ou outros órgãos.



  1. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE NO LACEN-GO

As amostras coletadas para os exames sorológicos (IgM e NS1) devem ser encaminhadas preferencialmente para os laboratórios descentralizados que atendem à demanda da Região de Saúde de sua abrangência. Nas Regiões onde este fluxo de encaminhamento e realização de exames sorológicos não está consolidado ou quando a demanda for maior que a capacidade de execução destes laboratórios, as amostras podem ser encaminhadas para o LACEN/GO.


O LACEN/GO realiza exames para o diagnóstico laboratorial da dengue, através da detecção do vírus e/ou alguns dos seus componentes (vírus, genoma viral e antígenos), ou pela a investigação de resposta sorológica após infecção. As metodologias utilizadas são:

  • Enzimaimunoensaio (ELISA) para IgM e NS1Ag;

  • Isolamento viral;

  • RT-PCR




  1. PESQUISA DE IgM PARA DENGUE




    1. Quando realizar a sorologia IgM

Deve-se realizar a sorologia no período epidêmico nas seguintes situações:



  1. Suspeita de dengue – recomenda-se coleta de forma amostral (um a cada 10 pacientes).

  2. Suspeita de dengue com sinais de alarme – coleta obrigatória em 100% dos casos.

  3. Suspeita de dengue grave e óbitos por dengue - coleta obrigatória em 100% dos casos.

Em períodos não epidêmicos a coleta deve seguir os seguintes critérios:



  1. Suspeita de dengue – recomenda-se coleta de 100% dos casos.

  2. Suspeita de dengue com sinais de alarme – coleta obrigatória em 100% dos casos.

  3. Suspeita de dengue grave e óbitos por dengue - coleta obrigatória em 100% dos



    1. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o diagnóstico sorológico - IgM

Colher assepticamente 10 ml de sangue preferencialmente entre o 7º e o 45º dia após o início dos sintomas (máximo até 90 dias em casos de investigação tardia), com seringa ou tubo a vácuo sem anticoagulante previamente identificado. Esperar a retração do coágulo por 30 minutos. Centrifugar a 4.000 rpm por 10 minutos e separar 2 a 4 ml de soro. Transferir o soro assepticamente para tubo plástico, estéril, com tampa de rosca, devidamente identificado e conservado em freezer a –20ºC1. Não se recomenda a utilização de amostras de soro que apresentam contaminação microbiana, hemólise ou lipemia.



Para assegurar a qualidade das amostras e garantir um diagnóstico em tempo hábil é necessário enviar imediatamente as amostras ao Laboratório Regional, quando descentralizado, ou ao LACEN/GO (não estocar amostras).

Colocar a amostra em saco plástico individualizado e transportá-la em caixa térmica com gelo reciclável. As amostras deverão estar acompanhadas de ficha epidemiológica devidamente preenchida e legível e ficha de cadastro no sistema Gerenciador de Ambiente Laboratorial (GAL).

O rótulo deve conter de forma legível o nome do exame, nome do paciente completo e por extenso, data da coleta, natureza da amostra e número da amostra (se 1ª ou 2ª amostra), usar etiquetas com tinta resistente aos meios de conservação.





Coleta

Armazenamento

Transporte

Observações

IgM

Soro
A partir do 6º dia de sintomas

(preferência entre o 7º e 45º dia)



-20°C (Congelar)
Alternativamente:

2 a 8°C (Refrigerar) por no máximo 72h, após esse período a amostra deve ser congelada



Enviar em até 7 dias
Gelo reciclável em caixa de isopor

AQDDa ou Confirmatório (indeterminados)
Soro 1: a partir do 6º dia de sintomas

Soro2: 15 dias após a coleta da primeira amostra.

aAQDD: Avaliação da Qualidade do Diagnóstico em Dengue


    1. Avaliação da Qualidade do Diagnóstico em Dengue (AQDD) – Sorologia IgM

Com a descentralização do diagnóstico sorológico IgM da dengue tornou-se necessário avaliar a qualidade do diagnóstico realizado pelos laboratórios municipais que fazem parte da rede laboratorial e recebem insumos do Ministério da Saúde para este fim.

Conforme Nota Técnica nº 41/03 e acordo firmado com a Superintendência de Vigilância em Saúde (SUVISA) o quantitativo de amostras que deverão ser enviadas ao LACEN/GO para “Avaliação da Qualidade do Diagnóstico em Dengue (AQDD)” deverá ser:



  1. Período Epidêmico: enviar ao LACEN/GO, 3% das amostras testadas (2% das amostras negativas e 1% das amostras positivas).

  2. Período Interepidêmico: enviar ao LACEN/GO, 10% das amostras testadas (7% das amostras negativas e 3% das amostras positivas).

As amostras destinadas a “AQDD” deverão ser armazenadas a -20ºC (freezer), transportadas com gelo reciclável em caixa térmica e enviadas juntamente com o formulário próprio, completamente e corretamente preenchido (ANEXO A), pelo menos a cada dois meses2. Enviar uma alíquota ao LACEN/GO e estocar outra alíquota para contraprova no laboratório de origem, quando esta se fizer necessária.

As amostras serão retestadas com o kit utilizado pelos laboratórios de origem das amostras e pela técnica “MAC-ELISA In House” padronizada pela Organização Mundial de Saúde (O.M.S.) e considerada padrão-ouro. Será avaliada a concordância dos resultados obtidos no laboratório de origem da amostra com os resultados do LACEN/GO. O resultado dessa avaliação será repassado ao laboratório municipal via ofício.

Esta avaliação serve como parâmetro para determinar a qualidade do kit e dos procedimentos técnicos empregados em sua utilização, a citar:

- Quando comparamos os resultados com o mesmo kit utilizado no município, pretendemos avaliar os procedimentos técnicos empregados na reação sorológica;

- Quando comparamos os resultados com a técnica padrão ouro para a sorologia da dengue, pretendemos avaliar a qualidade do Kit comercial distribuído aos municípios pelo Ministério da Saúde.

Sendo que, a partir do consolidado destas avaliações será possível estabelecer critérios para atualizações técnicas e capacitações dos técnicos nas reações sorológicas, além de subsidiar o Ministério da Saúde com dados sobre a qualidade dos kits descentralizados.




    1. Encaminhamento de amostras para exame confirmatório

As amostras que apresentarem resultados inconclusivos ou indeterminados, devem ser encaminhadas para realização de teste confirmatório no LACEN/GO, procedendo das seguintes formas:



  1. Retestar estas amostras antes de encaminhá-las ao LACEN/GO;

  2. Solicitar coleta de nova amostra, entre o 7º-45º dias após o inicio dos sintomas, e testá-la no laboratório municipal. Permanecendo o resultado inconclusivo, enviar 1ª e 2ª amostras ao LACEN/GO;

  3. Amostras enviadas para exame confirmatório devem ser cadastradas no GAL e vir acompanhadas de “Ficha de encaminhamento para realização de exame confirmatório” (ANEXO B) e da ficha epidemiológica de investigação;

  4. Resultado individual do exame confirmatório será liberado pelo LACEN/GO na plataforma GAL (Gerenciador de Ambiente Laboratorial) e o resultado estará disponível no próprio sistema.




  1. PESQUISA DO ANTÍGENO NS1 (NS1Ag)

A proteína não estrutural 1 presente nos vírus dengue (DENV) mais conhecida como NS1Ag é uma glicoproteína imunogênica que atua na fase precoce da infecção viral. Em sua forma solúvel pode ser detectada nas amostras de fase aguda da doença por testes imunocromatográficos e enzimaimunoensaios (ELISA). O NS1Ag é um ótimo biomarcador sorológico para o diagnóstico de dengue e sua detecção confirma a infecção pelos DENV. Entretanto, testes negativos não descartam a infecção por dengue.

Desde 2009, a partir de um projeto em conjunto com o Ministério da Saúde, o LACEN/GO realiza ELISA para detecção de NS1Ag com o objetivo de diagnosticar precocemente os casos de dengue, assim como, aprimorar o monitoramento viral dos DENV em Goiás.
4.1 Quando realizar a sorologia para detecção do antígeno NS1
A pesquisa do NS1Ag deverá ser realizada em amostras de pacientes com até 5 dias de sintomas de dengue, devendo-se dar preferência para amostras com até 3 dias do início dos sintomas e em todos os casos graves que necessitem do diagnóstico precoce da doença. Além de ser um teste diagnóstico utilizado na fase inicial da dengue, a detecção do antígeno NS1 tem sido empregada no LACEN/GO como teste de triagem para a técnica de isolamento viral.

Esta metodologia está descentralizada para os laboratórios municipais que realizam a sorologia IgM para dengue, podendo também ser empregada na rotina




    1. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o diagnóstico sorológico – NS1Ag

Coletar assepticamente 10 ml de sangue com seringa ou tubo a vácuo sem anticoagulantes, previamente identificado, em pacientes com até 5 dias do início dos sintomas, preferencialmente até o 3º. Esperar a retração do coágulo por 30 minutos. Centrifugar a 4.000 rpm por 10 minutos e separar 2 a 4 ml de soro.

O acondicionamento e transporte das amostras devem ser realizados da seguinte forma (ANEXO C):


  1. Quando for realizar apenas a detecção do antígeno NS1, coletar somente amostra de soro que deve ser armazenada sob-refrigeração entre 2° e 8°C por no máximo 72h, sendo que após este período a amostra deve ser obrigatoriamente armazenada a -20°C e transportada ainda congelada com gelo reciclável. Em até 07 dias a amostra deve ser encaminhada ao laboratório regional ou para o LACEN/GO para a realização oportuna da análise;

  2. Quando for realizar a pesquisa do NS1Ag, e isolamento viral em amostras de um mesmo paciente, deve-se coletar 02 amostras: 01 amostra de soro para NS1Ag e 01 amostra de sangue total para o isolamento viral. As amostras deverão ser acondicionadas individualmente em tubos criogênicos (criotubos) com tampa de rosca, fornecidos pelo LACEN/GO, e devem ser devidamente identificados e armazenados em um mesmo saco plástico, por paciente (um saco plástico para cada paciente). Estas amostras podem ser armazenadas sob refrigeração (2° e 8°C), por no máximo 48h até serem transferidas para o botijão de nitrogênio ou encaminhadas para o LACEN/GO. Nunca deixar estas amostras em temperatura ambiente (ANEXO C).

As amostras deverão estar acompanhadas de ficha epidemiológica e ficha do GAL devidamente preenchidas e legíveis.

O rótulo de cada amostra deve conter nome do exame, nome do paciente completo e por extenso, data da coleta, natureza da amostra e número da amostra (se 1ª ou 2ª amostra), usar etiquetas com tinta resistente aos meios de conservação e legível.



5. DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO - ISOLAMENTO VIRAL
Desde 1998 o LACEN/GO realiza o monitoramento dos vírus dengue através da técnica de isolamento viral em cultivo celular de linhagem C6/36 (células de mosquitos Aedes albopictus) e identifica os sorotipos (DENV-1, 2, 3 e 4) por imunofluorescência indireta e o resultado é liberado em até 30 dias após o recebimento da amostra pelo LACEN/GO.

Além do monitoramento dos sorotipos circulantes na região, este ensaio tem por objetivo detectar a introdução ou recirculação de um novo sorotipo viral. Essas informações são importantes para Vigilância Epidemiológica da dengue, alertando este sistema quanto às mudanças no perfil epidemiológico dos DENV em Goiás.

Desta forma, distribuiu-se a capacidade instalada do LACEN/GO em cotas a serem utilizadas pelas Regionais de Saúde, tornando-se imprescindível uma boa seleção dos pacientes elegíveis para a realização deste exame garantindo a promoção de uma efetiva vigilância epidemiológica dos vírus dengue em Goiás.

Para as coletas de isolamento viral o município deverá solicitar previamente à regional de saúde os criotubos para acondicionamento das amostras e combinar o número de amostras e o fluxo de encaminhamento das mesmas até a regional ou até o LACEN/GO, conforme as possibilidades de cada região.



As amostras para isolamento viral poderão ficar refrigeradas entre 2ºC e 8ºC por no máximo 48h, podendo ser encaminhadas ao LACEN/GO em caixas térmicas contendo gelo reciclável desde que não ultrapasse este tempo, sendo que no registro da amostra deverá conter a hora e data em que se processou esta coleta. Para um período superior a 48h as amostras devem ser armazenadas obrigatoriamente em nitrogênio líquido ou freezer a -80ºC.


    1. Quando realizar o isolamento viral

A amostra de sangue total deverá ser coletada até o 5° dia do inicio dos sintomas durante a fase de viremia da doença, que se inicia no período febril, dando-se preferência para coletas até o 3º dia de sintomas.

Um diagnóstico virológico de qualidade depende da coleta, acondicionamento e transporte adequados.


    1. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras para o isolamento viral

A coleta, acondicionamento e transporte das amostras devem ser realizados da seguinte forma (ANEXO C):



  1. Isolamento viral com triagem pelo NS1 - Preferencialmente devem ser coletadas amostras para realização do isolamento viral e detecção do NS1Ag em conjunto, neste caso, coletar 02 amostras: 01 soro para NS1Ag (teste de triagem) e 01 amostra de sangue total para o isolamento viral. As amostras deverão ser acondicionadas individualmente em tubos criogênicos (criotubos) com tampa de rosca, fornecidos pelo LACEN/GO, e devem ser devidamente identificados e armazenados em um mesmo saco plástico, por paciente (um saco plástico para cada paciente). Estas amostras podem ser armazenadas sob refrigeração (2° e 8°C), por no máximo 48h até serem transferidas para o botijão de nitrogênio ou encaminhadas para o LACEN/GO. Nunca deixar estas amostras em temperatura ambiente (ANEXO C).

  2. Isolamento viral sem triagem pelo NS1 - Quando não for possível separar o soro para realizar a triagem pelo teste NS1Ag o sangue total (sem anticoagulante) deverá ser acondicionado individualmente em tubos criogênicos (criotubos) com tampa de rosca, fornecidos pelo LACEN/GO, e devem ser devidamente identificados e armazenados em saco plástico indivual, por paciente (um saco plástico para cada paciente). Estas amostras podem ser armazenadas sob refrigeração (2° e 8°C), por no máximo 48h até serem transferidas para o botijão de nitrogênio ou encaminhadas para o LACEN/GO. Nunca deixar estas amostras em temperatura ambiente (ANEXO C).


Nota: As amostras devem ser encaminhadas ao LACEN/GO em até 07 dias após a coleta para a realização dos testes em tempo oportuno.
SOBRE O MANUSEIO DO BOTIJÃO, VALE LEMBRAR:

  • Colocar a amostra em saco plástico individualizado dentro de uma canaleta identificada no botijão contendo nitrogênio líquido, preferencialmente, imediatamente após a coleta. Sugere-se tampar a canaleta do botijão com um chumaço de algodão ou gaze para que o tubo não se perca dentro deste.

  • No caso de múltiplas coletas, em um mesmo período, para evitar a abertura excessiva do botijão de nitrogênio, pode-se manter a amostra sob refrigeração (entre 2º e 8ºC – geladeira) por no máximo 48h, mas nunca em temperatura ambiente, após este prazo a amostra deve ser imediatamente acondicionada no botijão contendo nitrogênio líquido e encaminhada o quanto antes para o LACEN/GO.

  • As amostras deverão estar acompanhadas de ficha epidemiológica e ficha do GAL devidamente preenchidas e legíveis. O rótulo deve conter de forma legível nome do exame, nome do paciente completo e por extenso, data da coleta, natureza da amostra e número da amostra (se 1ª ou 2ª amostra), usar etiqueta com tinta resistente aos meios de conservação (sugestão: utilizar esparadrapo para o rótulo – etiquetas de papel não resistem ao procedimento de conservação no nitrogênio líquido).

Os tubos para acondicionamento das amostras de sangue total para o diagnóstico virológico (criotubos) serão disponibilizados pelo LACEN/GO às regionais de saúde conforme cota mensal estabelecida (ver tabela 1). Ficará sob a responsabilidade da regional de saúde a distribuição dos tubos para os municípios pertencentes à sua região, assim como o gerenciamento dos botijões de nitrogênio entre os municípios.

O preenchimento com nitrogênio líquido, dos botijões disponibilizados para as Regionais, ficará à cargo do LACEN/GO.
5.3 Cotas mensais de envio de amostras para o isolamento viral de dengue
Foram estabelecidas cotas mensais para envio de amostras para diagnóstico virológico (isolamento viral) de acordo com a capacidade instalada do LACEN/GO, população residente e perfil epidemiológico dos municípios que pertencem a cada região de saúde conforme tabela a seguir:


REGIONAL DE SAÚDE

NÚMERO DE AMOSTRAS/COTA MÊS

ARS São Patrício

20

ARS Norte

10

ARS Serra da Mesa

10

ARS Pirineus

30

ARS Central

100

ARS Centro/Centro Sul

50

ARS Rio Vermelho

10

ARS Oeste I

10

ARS Oeste II

10

ARS Entorno Norte

20

ARS Nordeste I

05

ARS Nordeste II

05

ARS Entorno Sul

50

ARS Sudoeste I

20

ARS Sudoeste II

10

ARS Estrada de Ferro

20

ARS Sul

20

Tabela 1 - Cotas para o isolamento viral – LACEN/GO



  1. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DENGUE POR BIOLOGIA MOLECULAR / RT-PCR

O diagnóstico molecular da dengue é fundamental para a identificação dos sorotipos virais circulantes e detecção precoce do surgimento de um novo sorotipo, contribuindo de maneira importante para o sistema de vigilância epidemiológica da doença. A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é útil durante o período de viremia da doença.

A viremia inicia-se durante o período febril, e uma amostra adequada para realização de RT-PCR teria de ser coletada preferencialmente durante os cinco primeiros dias de sintomas, sendo até o 7º dia passível de realização do teste em casos excepcionais. Amostras coletadas a partir do sétimo dia até o décimo apresentam baixíssima chance de serem detectadas por esta metodologia.

O teste de Detecção Qualitativa do RNA do vírus Dengue é direcionado para identificação diagnóstica de sorotipo viral em casos graves de Dengue com complicação neurológica ou quadros de infecção crônica com suspeita de viremia, além de casos de diagnóstico diferencial pós mortem. Desta forma os principais espécimes clínicos utilizados para pesquisa do vírus Dengue por RT-PCR são SORO e LCR (Liquido Cefalorraquidiano).

Para realização do exame a amostra deverá estar acompanhada de pedido médico da unidade de Saúde e cópia da ficha epidemiológica de registro no SINAN.

A realização de um exame de biologia molecular de qualidade depende essencialmente de coleta, armazenamento e transporte realizados de maneira adequada das amostras a serem realizadas.




    1. Coleta, identificação, acondicionamento e transporte de amostras biológicas para realização do teste de RT-PCR para dengue

A pesquisa do vírus Dengue por RT-PCR será realizada prioritariamente, em dois espécimes clínicos, segundo as seguintes determinações:



  1. Soro (1 mL) - Coletar assepticamente 2 a 5 ml de sangue com seringa ou tubo a vácuo sem anticoagulantes entre 1º e 5º dia após o início dos sintomas. Separar o soro após a retração do coágulo em tempo mínimo possível (centrifugar a 1.500 rpm, durante 10 minutos). A amostra pode ficar a temperatura ambiente por no máximo 2 horas ou em geladeira (4ºC) por no máximo 4 horas até o envio ao laboratório. Armazenamento no LACEN-GO a -80ºC.

  2. LCR (1 mL) – Líquido Cefalorraquidiano / Liquor - Após coleta, o material deve ser colocado em criotubo estéril e devidamente rotulado com os dados do paciente, enviado imediatamente ao laboratório em até 2 horas ou acondicionado em botijão contendo nitrogênio líquido até o envio. Estocagem em geladeira (4ºC) até o envio, por no máximo 2 horas. Armazenamento no LACEN/GO a -80ºC.

As amostras deverão ser acondicionadas em tubos plásticos descartáveis estéreis com tampa de rosca, devidamente rotulados e lacrados. Vale ressaltar que estes tubos devem suportar congelamento as baixas temperaturas (tubos criogênicos). Após a coleta e congelamento para envio ao LACEN/GO em hipótese alguma o material deverá ser descongelado, o que inviabiliza a realização do exame.


    1. Orientação para rotulagem e envio das amostras ao LACEN/GO – RT-PCR

Colocar a amostra em saco plástico individualizado (separar por paciente), dentro de uma canaleta identificada no botijão de nitrogênio líquido, imediatamente após a coleta e preparação. Sugere-se tampar a canaleta do botijão com um chumaço de algodão para que o tubo não se perca dentro deste. No caso de envio da amostra em isopor contendo gelo seco, observar se a quantidade do mesmo é suficiente até a chegada da caixa de isopor ao LACEN-GO.

As amostras deverão estar acompanhadas de ficha epidemiológica devidamente preenchida e legível ou cópia da mesma, pedido médico específico para teste de biologia molecular (RT-PCR para Dengue) com descritivo da suspeita médica. No caso de solicitações realizadas pelo GAL (Gerenciador de Ambiente Laboratorial), a amostra deve estar acompanhada da ficha de encaminhamento devidamente preenchida própria do sistema GAL.

O rótulo deve conter nome do exame, nome do paciente completo e por extenso, data e hora da coleta e natureza da amostra, usar etiquetas com tinta resistente aos meios de conservação e escrita de forma legível.




    1. Realização do diagnóstico molecular para dengue

O teste de detecção e tipagem do RNA do vírus dengue por RT-PCR é realizado pela Seção de Biologia Molecular do LACEN/GO, utilizando-se a amplificação do RNA do vírus por RT-PCR “in house”, com a utilização de conjuntos de primers específicos para os quatro sorotipos do vírus dengue; segundo Lanciotti et. al., 1992, e as orientações do “Manual De Técnicas para o Diagnóstico Laboratorial de Dengue do Ministério da Saúde”, de Julho de 2006.







Coleta

Armazenamento

Transporte

Observações

RT-PCR

Soro
1-5 dias de sintomas

Botijão de Nitrogênio
Alternativamente:

2 a 8°C (Refrigerar) máx. 4hs até chegar no LACEN-GO




Botijão de Nitrogênio
Gelo reciclável em caixa de isopor no máximo 4h entre coleta e entrega no LACEN/GO)

Solicitar o botijão de nitrogênio à regional de saúde com antecedência



  1. DIAGNÓSTICO EM CASOS DE ÓBITO COM SUSPEITA DE DENGUE



    1. Instruções para a coleta de amostras em situação de óbito

Recomendações para os óbitos suspeitos de dengue sem o diagnóstico etiológico prévio (ANEXO D).



Em se tratando de óbito devem-se garantir as amostras necessárias para a investigação laboratorial e confirmação diagnóstica, sendo que as amostras preferenciais devem ser sangue total, soro e vísceras, podendo em alguns casos serem utilizadas outras amostras como líquor, líquido ascítico, etc.


  1. Sangue total e soro - para obtenção de sangue total e soro deve ser coletado sangue por punção intra-cárdica em até 8h após o óbito ou em vasos de grande calibre como a femoral e jugular, obtendo-se assim:




  1. Duas amostras de soro.

Que serão utilizadas pelo LACEN/GO para as técnicas de sorologia Elisa (IgM e/ou NS1) e PCR. Sendo que uma amostra deve ser obrigatoriamente armazenada em botijão de nitrogênio (com um mínimo de 12cm de nitrogênio) para a técnica de PCR e a outra amostra pode ser armazenada em botijão de nitrogênio ou sob refrigeração em temperatura entre 2ºC e 8ºC, para as técnicas Elisa.


  1. Uma amostra de sangue total.

Que será utilizada pelo LACEN/GO para a técnica de isolamento viral. Sendo que esta amostra pode ser armazenada entre 2º e 8ºC por no máximo 48h e para período maior, obrigatoriamente armazenada em botijão de nitrogênio (com um mínimo de 12 cm de nitrogênio).



  1. Vísceras - devem ser coletadas amostras de fígado, pulmões, rins, baço e cérebro, sendo estes os espécimes de escolha para as análises anatomopatológicas, PCR e isolamento viral em vísceras. Coletar no mínimo 2 (dois) fragmentos de cada tecido com dimensões aproximadas de 1 a 2 cm3.

Estes fragmentos devem ser segregados e armazenados da seguinte forma:


  1. Vísceras “in natura” para isolamento viral e PCR.

Acondicionar separadamente (por sítio) em criotubos, que devem estar devidamente identificados com o nome do paciente, data da coleta e tipo de amostra. Não é necessário nenhum conservante ou meio de cultura. Estes criotubos devem ser armazenados imediatamente em botijão de nitrogênio (mínimo de 12cm de nitrogênio).


  1. Vísceras para anatomopatológico (histopatológico e Imunohistoquímica).

Acondicionar separadamente (por sítio) em tubos tipo falcon, preferencialmente de 15ml, contendo formalina tamponada a 10% ou em blocos de parafina. O volume de formalina tamponada a 10% deve ser suficiente para cobrir em até duas vezes a amostra acondicionada, não devendo ficar nenhuma parte da amostra fora do líquido. Os tubos ou blocos de parafina devem estar devidamente identificados com o nome do paciente, data da coleta e tipo de amostra, devendo ser armazenados à temperatura ambiente.


  1. Líquidos cavitários – pleural, ascítico e pericárdio.

Coletar líquidos cavitários para realização de RT-PCR. As amostras devem ser acondicionadas em criotubos devidamente identificados e armazenados em botijão contendo nitrogênio líquido.

Vale ressaltar que as amostras coletadas de órgãos diferentes devem ser acondicionadas em recipientes separados e identificados – um tubo para cada tipo de amostra e exame a que se destina, por exemplo: um criotubo com pulmão (que vai ser armazenado no botijão para PCR) e outro tubo tipo falcon com formalina contendo outra peça do pulmão (armazenado em temperatura ambiente para os exames anatomopatológicos).

Espécimes de qualquer outro órgão, mostrando aparente alteração macroscópica, podem ser encaminhados para investigação de etiologia viral.

Todas as amostras, ao serem encaminhadas para o LACEN/GO, devem estar acompanhadas da ficha de notificação (SINAN), ficha do SVO (solicitação de exame anatomopatológico), ficha impressa do cadastro no GAL, lista impressa de exames encaminhados para o Lacen (GAL) e o laudo médico ou histórico do paciente (quando houver).

As amostras que não são processadas no Lacen, como as vísceras para o anatomopatológico, são encaminhadas para o Instituto Evandro Chagas, em Belém do Pará, sendo este um Laboratório de Referência Nacional para este agravo.

Tão logo estes resultados sejam recebidos pelo Lacen, ficam disponíveis para os solicitantes, que são antes disto, notificados sobre os casos positivos por e-mail, pelo Núcleo de Vigilância Laboratorial do Lacen (ANEXO D).




  1. FLUXO DE RESULTADOS

O sistema GAL já está implantado em todo o Estado de Goiás, sendo que os municípios e unidades estaduais devem cadastrar todos os exames solicitados no GAL. E, após a liberação dos resultados o laudo ficará disponível imediatamente no próprio sistema para impressão pelos solicitantes, diminuindo o tempo de espera e otimizando os resultados.


Para o isolamento viral em vísceras, PCR em vísceras e anatomopatológico o LACEN/GO encaminha as amostras para o Instituto Evandro Chagas, que é o Laboratório de Referência Nacional em dengue e os resultados provenientes deste laboratório são recebidos por e-mail e posteriormente via malote, sendo repassados, via ofício, para a Gerência de Vigilância Epidemiológica das Doenças Transmissíveis e para o SVO da cidade de Goiânia, que detêm o maior número de óbitos enviados ao Lacen. No entanto, os casos positivos são notificados por e-mail, pelo Núcleo de Vigilância Laboratorial do LACEN/GO (VIDE ANEXO D).

Obs.: A Coordenação de Dengue e Febre Amarela da SES (SUVISA) tem acesso aos relatórios e resultados liberados pelo Lacen através do GAL. Todo resultado positivo para agravos de notificação compulsória e/ou imediata é notificado imediatamente à Coordenação Geral de Laboratório - CGLAB, à Vigilância Epidemiológica Estadual e ao município de notificação via e-mail.

Os casos de óbitos suspeitos de Dengue são acompanhados pela Seção de Vigilância Laboratorial do LACEN/GO e os resultados são encaminhados a partir desta seção.




  1. BIBLIOGRAFIA

Brasil 2002. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Programa Nacional de Controle da Dengue – PNCD/Fundação Nacional de Saúde. Brasília, 2002.


______2006. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de técnicas para o diagnóstico laboratorial de dengue. Brasília, 2006.
______2009a. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Diretrizes Nacionais para Prevenção e Controle de Epidemias de Dengue. 1º ed. Brasília, 2009.
______2009b. Dengue. In Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, departamento de vigilância epidemiológica, Guia de Vigilância Epidemiológica, 7 ed, Editora MS, Brasília-DF. p. 1-21.
______2011. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Diretoria Técnica de Gestão. Dengue: diagnóstico e manejo clínico – adulto e criança. 4. ed. Brasília, 2011.
Igarashi A. Isolation of a Singh's Aedes albopictus cell clone sensitive to dengue and chikungunya viruses. J. Gen. Virol 1978;40:531-44
Kuno G, Gomez I, Gubler DJ. Detecting artificial antidengue IgM immune complexes using an enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Trop Med Hyg. 1987;36:153–9.
Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1992;30:545–51.
Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Coordenação Geral do Programa Nacional de Controle da Dengue. Reunião Nacional de Atualização da Vigilância Epidemiológica da Dengue. Estudo de caso – Aplicação da nova classificação dos casos de dengue. Brasília: Ministério da Saúde, 02 e 03 out. 2013.
WHO 2009. Dengue: Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. New ed., TDR: World Health Organization, Geneva, x, 147 pp.

ANEXOS

ANEXO A: FORMULÁRIO DE AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DIAGNÓSTICO DE DENGUE – SOROLOGIA IgM



ANEXO B: FICHA DE ENCAMINHAMENTO PARA REALIZAÇÃO DE EXAME CONFIRMATÓRIO



ANEXO C: FLUXO DE EXAMES PARA DENGUE – LACEN/GO


Paciente com suspeita de Dengue

Febre com duração máxima de 7 dias com duas ou mais manifestações (cefaléia, dor retrorbitária, prostração, mialgia, artralgia, nauseas, vômitos, etc)





autoshape 1349autoshape 1350

Paciente com até 05 dias de sintomas.



Preferencialmente até o 3° dia

Paciente com mais de 07 dias de sintomas

Isolamento Viral


IgM

autoshape 1359 autoshape 1359 autoshape 1359


NS1Ag (rotina)

autoshape 1359autoshape 1359autoshape 1359


01 amostra de soro:

- 01 para NS1Ag



01 amostra de sangue total:

- 01 isolamento viral




01 amostra de soro:

- sorologia IgM


01 amostra de soro:

- sorologia NS1Ag


autoshape 1359autoshape 1359

autoshape 1359

Até 48h - Refrigerado 2ºC a 8ºC

Mais que 48h - Botijão de nitrogênio

REFRIGERADO 2ºC A 8ºC




autoshape 1356


LACEN:

- Amostras

- Fichas de notificação

- Fichas de cadastro no Gal

- Lista de exames encaminhados para a rede de laboratórios (GAL)

autoshape 1355

autoshape 1347
Resultado NS1Ag

Liberação em 07 dias


Resultado sorologia IgM

Liberação em 07 dias

Resultado RT-PCR

Liberação em 21 dias

Resultado isolamento viral

Liberação em 30 dias

rectangle 1336

GAL

COORD. ESTADUAL /

REGIONAIS DE SAÚDE


MUNICÍPIO SOLICITANTE



autoshape 1359autoshape 1360

ANEXO D: FLUXO DE EXAMES EM CASO DE ÓBITO SUSPEITO POR DENGUE – LACEN/GO


Óbito suspeito de Dengue

Febre com duração máxima de 7 dias com duas ou mais manifestações (cefaléia, dor retrorbitária, prostração, mialgia, artralgia, nauseas, vômitos, etc)




autoshape 1388autoshape 1389


Coletar fragmentos de vísceras (tamanho 1 a 2mm3) de fígado, pulmão, rim, baço e cérebro, até 24h após o óbito.

Coletar soro e sangue total por punção intra-cárdica ou veias calibrosas até 8h após o óbito.


autoshape 1366autoshape 1367autoshape 1368
Se possível, separar:

02 amostras de soro;

- 01 para sorologia

- 01 para RT-PCR

01 amostra de sangue total:

- 01 isolamento viral




Vísceras para histopatológico e Imunohistoquímica. Acondicionar separadamente (por sítio) em tubos contendo formalina tamponada a 10% ou montar blocos de parafina.


Vísceras “in natura” para isolamento viral e RT-PCR.

Acondicionar separadamente (por sítio) em criotubos. Não é necessário nenhum tipo de conservante.





BOTIJÃO DE NITROGÊNIO
Para a sorologia, o material pode ser armazenado sob refrigeração entre 2ºC a 8ºC


TEMPERATURA AMBIENTE



BOTIJÃO DE NITROGÊNIO


LACEN:

- Amostras

- Ficha de notificação

- Ficha SVO (solicitação de exame anatomopatológico)

- Ficha de cadastro no Gal

- Lista de exames encaminhados para a rede de laboratórios (GAL)

- Laudo médico (quando houver)



autoshape 1364autoshape 1365

Resultado sorologia 07 dias


Laboratório de Referência Nacional – Instituto Evandro Chagas (Belém-PA)

Resultado RT-PCR 21 dias

Resultado isolamento viral 30 dias


RESULTADO IMPRESSO RECEBIDO PELO LACEN

GAL

autoshape 1390 autoshape 1391

rectangle 1369
COORD. ESTADUAL /

REGIONAIS DE SAÚDE


MUNICÍPIO SOLICITANTE





1 NÃO UTILIZAR ESPARADRAPO OU OUTRA FITA ADESIVA PARA VEDAR A TAMPA DO TUBO.

2 O ENVIO DE AMOSTRAS PARA O “AQDD” É OBRIGATÓRIO E O DESCUMPRIMENTO PODE ACARRETAR EM NÃO RECEBIMENTO DE KITS PARA O PERÍODO SUBSEQUENTE.



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