Dosagem da gama gt



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DA GAMA GT

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POPBIO 038

Revisão: 00




GAMA GT-PP
FUNDAMENTO

A gama- glutamiltransferase (Gama GT) catalisa a transferência do grupamento gamaglutamil da gamaglutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a glicilglicina liberando gamaglutamilglicilglicina e p-nitroanilina.

A p-nitroanilina apresenta elevada absorção em 405 e a quantidade liberada é diretamente proporcional à atividade da Gama GT na amostra.

A atividade catalítica é determinada a partir da velocidade de formação da p-nitroanilina.


-GT

-Glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + Glicilcina  -glutamilglicilglicina + p-nitroanilina



APLICAÇÃO CLÍNICA

A dosagem da GAMA GT no soro é empregada principalmente para avaliar colestases hepáticas doenças obstrutivas da árvore biliar, alcoolismo e monitorização de algumas drogas.


AMOSTRA

Preparo do Paciente

Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.



Amostras utilizadas

Soro ou Plasma (EDTA).



Estabilidade e armazenamento da amostra

O analito é estável por 5 dias entre 2 -8C.



Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).



Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).



Critérios para rejeição da amostra

Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

GAMA GT PP CAT. 461 MS 80022230076

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil
Farmacêutico Responsável: José Gilmar Pereira Berto - CRF-MG 13421
Componentes do kit

Conservar entre 2-8ºC.



1- Tampão - Contém glicilglicina 197 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
2- Substrato - Contém gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida 21 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.

3- Padrão – Equivale a 125 U/L. Contém p- nitroanilina 500 µmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.

O Padrão se aplica a metodologia cinética de tempo fixo.



Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.



Sinais de Deterioração dos Reagentes

  1. Presença de partículas e turbidez indicam deterioração dos reagentes.

  2. A Absorbância do Reagente de Trabalho em 405 nm deverá ser inferior a 1,5 durante toda a sua utilização ou até a expiração da data de validade do mesmo.



Precauções e Cuidados Especiais

  1. Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

  2. Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

  3. De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

  4. Os reagentes contêm azida sódica como conservante. Evitar contato com os olhos, pele e mucosa. Não aspirar ou ingerir.

  5. Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.



EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

  • Fotômetro com cubeta termostatizada em 37°C para método cinético contínuo;

  • Banho-maria a 37°C para método cinético de tempo fixo;

  • Solução de ácido acético a 5% v/v para método cinético de tempo fixo;

  • Tubos e Pipetas;

  • Cronômetro.


Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.



Influências Pré-analíticas

Nas mulheres, a atividade da Gama GT é mais baixa do que nos homens de mesma idade.

A ingestão de álcool aumenta consideravelmente a atividade da Gama GT.

Valores falsamente elevados de Gama GT forma observados em pacientes tomando drogas anticonvulsivantes.



Preparo do Reagente de Trabalho


De acordo com o consumo, misturar suavemente, os reagentes 1 e 2 na seguinte proporção: 4 volumes de Tampão (1) mais 1 volume de Substrato (2). O Reagente de Trabalho é estável por 21 dias entre 2-8ºC.
PROCEDIMENTO

A- Técnica de Análise sem Padrão – Método Cinético Contínuo

1-Pipetar na cubeta ou tubo:



Reagente de Trabalho


1000 µL


Amostra

50 µL

2-Homogeneizar, inserir a cubeta no porta-cubetas termostatizado a 37°C e acionar o cronômetro.

3-Após 1 minuto, fazer a leitura da absorbância inicial (A0).

4-Fazer novas leituras de absorbância, após exatamente 1,2 e 3 minutos.

5-As diferenças entre as absorbâncias (∆A/minuto) devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método.

6-Calcular o aumento de absorbância médio por minuto (∆A/minuto médio).


CÁLCULOS

Ver Linearidade.

Considerando que o coeficiente de absorção milimolar da p-nitroanilina é 8,235 em 405 nm, deduz-se a seguinte fórmula para calcular a atividade catalítica:
U/L de Gama GT = ∆A/ minuto médio × 2550

Onde ∆A/ minuto = Variação média da absorbância por minuto.



Exemplo

Se ∆A/ minuto médio do Teste = 0,022

U/L de Gama GT = 0,022 × 2550

U/L de Gama GT= 56 U/L


Cálculo do fator:

Fator = Vt x 1000

x Va x d


Vt = volume total do ensaio = 1050 µL

Va = volume da amostra = 50 µL

1000 = conversão de U/mL para U/L

d = espessura da cubeta, via da luz = 1 cm

 = absortividade milimolar da p-nitroanilina em 405 nm = 8,235



Fator = 1050 x 1000 = 2550

8,235 x 50 x 1


B- Técnica de Análise com Padrão – Método cinético de tempo fixo

Nota: Esta metodologia requer a utilização de uma Solução de Ácido Acético a 5% (v/v).


Calibração do ensaio

Dosar o Padrão em triplicata

1-Identificar os tubos de ensaio com “Branco” e “Padrão” e proceder:


Tubos

Branco

Padrão

Água deionizada

500 µL

500 µL

Padrão (1)

------------

50 µL

Ácido Acético 5%

1000 µL

1000 µL

2-Homogeneizar e medir as absorbâncias do Padrão (triplicata) em 405nm (400 a 420nm), acertando o Zero do aparelho com o tubo Branco.

3- Calcular a média das absorbâncias do Padrão.
Dosagem do Teste

1-Identificar os tubos de ensaio com “Branco” e “Teste” e proceder:




Tubos

Branco

Teste

Reagente de Trabalho

500 µL

500 µL

2-Incubar os tubos por 2 minutos no banho-maria a 37°C.

3-Adicionar ao tubo Teste 25 µL de amostra.

4-Homogeneizar e deixar por 10 minuto (Cronometrar) no banho-maria a 37°C.

5-Adicionar aos 2 tubos (Branco e Teste) 1000 µL de Solução de Ácido Acético a 5% (v/v).

6-Homogeneizar e adicionar ao tubo Branco 25 µL de amostra.

7-Homogeneizar e medir as absorbâncias do Teste em 405 nm (400 a 420 nm), acertando o Zero do aparelho com o tubo Branco.
Cálculos

Ver linearidade

Como a metodologia obedece à lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do Fator de Calibração (FC).

CP = Concentração do Padrão = 125 U/L

AP média = Média das absorbâncias do Padrão

CT = Atividade de Gama GT em U/L

AT = Absorbância do Teste

FC = Fator de Calibração = CP ÷ AP média do Padrão


Exemplo

Se AP média do Padrão = 0,162

Se AT = 0,085

CP = 125 U/L

FC = Fator de Calibração = CP ÷ AP média do Padrão = 125 ÷ 0,162 = 772

CT = Atividade de Gama GT do Teste em U/L = 0,085 × FC

CT = 0,085 × 772 = 65,6 = 66 U/L
Atenção

• As técnicas apresentadas são adequadas para fotômetros cujo volume mínimo de solução para a leitura é igual ou menor do que 1000 µL.

• O analista sempre deve fazer uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro empregado no sue laboratório.

• Os volumes de amostra e de reagente podem ser modificados proporcionalmente, sem alterar o desempenho do teste e os cálculos.

• Em caso de redução dos volumes é necessário observar o volume mínimo de leitura fotométrica.

• Volumes da amostra menores do que 10 µL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição.



RESULTADOS


Unidade Convencional (U/L) × 16,7 = Unidade SI (nkat/L)

CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade: PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC



Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DE REFERÊNCIA


Homens: < 60 U/L

Mulheres: < 40 U/L


Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.
SIGNIFICADO CLÍNICO

A Gama GT é uma enzima encontrada em concentração relativamente alta nos rins, pâncreas, fígado e próstata, e é um sensível indicador de doenças inflamatórias e de lesão ocupando espaço no fígado, estando significativamente elevada nas doenças obstrutivas hepatobiliares. A Gama GT tem maior especificidade que a fosfatase alcalina (ALP) e a TGO (AST) para avaliar doença hepática porque ela não se eleva na doença óssea como a ALP e nem doenças do músculo esquelético como a transaminase oxalacética (TGO).

A determinação da Gama GT serve para diferenciar colestases mecânica e viral das induzidas por drogas. Nas duas primeiras, a Gama GT e ALP estão igualmente elevadas. Nas colestases induzidas por drogas os valores da Gama GT são muito mais altos.

Os níveis de Gama GT encontram-se altos em pacientes que fazem uso prolongado de drogas que induzem o sistema microssomal hepático como o fenobarbital, fenitoína, entre outras.

Valores elevados de Gama GT em pacientes anictéricos com câncer são um seguro indicador de metástases hepáticas.

A Gama GT é muito sensível na seleção de alcoólatras. No alcoolismo crônico, os níveis séricos da Gama GT diminuem com a retirada do álcool e se elevam com a exposição ao mesmo. Com base nesta observação, a dosagem da GGT é utilizada nos centros de tratamentos de alcoólatras para documentar o sucesso da terapia e identificar os pacientes que retomaram ao alcoolismo após a alta.


LINEARIDADE

A reação é linear até 700 U/L. Para valores maiores, diluir a amostra com solução de NaCL 150 mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.


LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Fundamento de Química Clínica, 4a Ed - Guanabara Koogan; 1998.

  2. The Committee on Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Scand. J Clin Lab Invest 1976;36:119.

  3. .Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificação para Avaliação, Qualimark Editora, Rio de Janeiro, 1997.

  4. IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes-Part 4. IFCC Method for -Glutamyltransferase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:633-45.

  5. Internacional Federation of Clinical Chemistry, Expert Panel on Enzymes. Clin Chim Acta 1983, 135:315F.

  6. Sociedad Española de Química Clínica, Comité Científico, Comisión de Enzimas. Quim Clin 1990; 9:58-61.

  7. Szasz, G.: Clin Chem 1969;15:124.

  8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR. Clin Chem 1981;27:493-501.

  9. GAMA GT-PP, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica.







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Razão:







Número

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