Dosagem do ldl



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DO LDL

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POPBIO 048

Revisão: 00




LDL DIRETO-PP
FUNDAMENTO

Por ação combinada de um detergente específico, as lipoproteínas de alta densidade (HDL), as de muito baixa densidade (VLDL) e os quilomicrons presentes na amostra analisada são solubilizadas.

Os ésteres de colesterol são hidrolisados por ação da enzima colesterol esterase e colesterol oxidase mediante uma reação não formadora de cor. O segundo detergente presente no Tampão 2 solubiliza o colesterol das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) da amostra que em seguida, é determinado espectrofotometricamente através das reações descritas abaixo.
Colesterol esterificado + H20 Colesterol esterase Colesterol + àcido graxo



Colesterol + H20 + 1/2O2 Colesterol Oxidase Colestenona + H2O2
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + DSBmT Peroxidase Quinoneimina + 4H2O

DSBmT = N,N-bis(4-sulfobutil)-m-toluidina




APLICAÇÃO CLÍNICA

A determinação dos níveis de Colesterol LDL juntamente com o Colesterol total e o Colesterol HDL no soro é sempre solicitada para avaliar o fator de risco de uma pessoa desenvolver a Doença Arterial Coronariana (DAC). O colesterol LDL mantém uma relação direta com a prevalência da enfermidade coronariana, isto é, quanto maior o seu teor na circulação maior o risco de DAC.

Deste modo, valores elevados de Colesterol LDL estão associados com risco aumentado de DAC.



AMOSTRA

Preparo do Paciente

A amostra de sangue deve ser colhida após um jejum de 12 horas para evitar a interferência da lipemia pós-prandial que geralmente está presente em amostras obtidas sem jejum.



Amostras utilizadas

Soro ou plasma (heparina ou EDTA).



Estabilidade e armazenamento da amostra

O analito é estável por 5 dias entre 2-8C.



Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).



Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).



Critérios para rejeição da amostra

Não usar amostras fortemente hemolisadas ou com sinais de contaminação bacteriana.



Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

LDL DIRETO-PP CAT. 401 MS 80022230072

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil
Farmacêutico Responsável: José Gilmar Pereira Berto - CRF-MG 13421
Componentes do kit

Conservar entre 2 a 8 ºC.


  1. Tampão 1 – Contém tampão MES pH 6,3 > 30 mmol/L; colesterol esterase <1500 U/L; colesterol oxidase <1500 U/L; 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L; ascorbato oxidase < 3,0 U/L; peroxidase > 1000 U/L e detergente.




  1. Tampão 2 – Contém tampão MES pH 6,3 > 30 mmol/L; N,N-bis (4-sulfobutil)-m-toluidina (DSBmT) 1 mmol/L e detergente.


  1. Calibrador – Contém soro humano liofilizado com a concentração de colesterol LDL determinada. A concentração do Calibrador está impressa no rótulo do frasco.

MES = Ácido(2-[N-Morfolino]etanosulfônico)



Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.


Precauções e Cuidados Especiais

  1. Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

  2. Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

  3. De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

  4. O Calibrador (3) por ser derivado do sangue humano foi testado para anticorpos anti-HCV e anti-HIV e antígeno HBsAg e apresentou resultado negativo. No entanto, deve ser tratado com precaução, como potencialmente infectante. Manusear e descartar segundo as normas de biossegurança.

  5. O Calibrador contém azida sódica como conservante. Não aspirar ou ingerir. Evitar contato com os olhos e pele.

  6. Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.



EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

  • Espectrofotômetro (leitura entre 546/700 nm);

  • Tubos e Pipetas;

  • Banho-maria ou termostatizador constante de 37°C;

  • Cronômetro.


Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.


Procedimento em Analisadores Automáticos

Mencionar o manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes para o sistema automático.


Interferências

A hemólise (hemoglobina até 500 mg/dL), a bilirrubina até 20 mg/dL e a lipemia (triglicérides até 1290 mg/dL) não interferem.


Alguns medicamentos e substâncias podem interferir.

Preparo de Reagentes


  1. Os tampões 1 e 2 estão prontos para uso.

  2. Preparo do Calibrador

Reconstituir o conteúdo do frasco de Calibrador (3) com exatamente 1 mL de água recém destilada ou deionizada. Fechar o frasco e homogeneizar cuidadosamente para dissolver todo o liofilizado. Evitar formação de espumas. Deixar em repouso por 30 minutos antes do uso. Estável por 7 dias entre 2 a 8ºC.

PROCEDIMENTO

A - Condições de Reação

Cumprimento de onda principal: 546 +- 20 nm

Cumprimento de onda secundário: 700 +- 20 nm

Cubeta: 1 cm

Temperatura: 37ºC

Medida: contra água deionizada.


B-Técnica de Análise

Procedimento Técnico Manual

Nota

Esta técnica não se aplica em analisadores semi-automáticos que utilizam somente cubeta de fluxo.

1-Identificar 2 tubos de ensaio com “Teste” e “Calibrador” e proceder:


Tampão 1

750 L

Amostra ou Calibrador

10 L

2-Homogeneizar e incubar a 37°C por 5 minutos.

3- Fazer a leitura fotométrica (A1) do Teste e do Calibrador em 546 nm acertando o Zero de absorbância com água deionizada.

4-Adicionar aos tubos de ensaio:


Tampão 2

250 L

5-Homogeneizar e incubar a 37°C por 5 minutos.

6-Fazer nova leitura fotométrica (A2) do Teste e do Calibrador em 546 nm acertando o Zero de absorbância com água deionizada.

As absorbâncias são estáveis por 15 minutos.

CÁLCULOS

CC = Concentração do Calibrador (vem indicada no rótulo do frasco).

CT = Concentração do Teste

AC = Absorbância do Calibrador

AT = Absorbância do Teste

Como a metodologia obedece a lei de Lambert-Beer, calcular a concentração do teste através do Fator de Calibração (FC).

Ct= Fc x (A2- A1 ) T

Fc = Cc

(A2 – A1)C



Exemplo

Cc=112 mg/dL

A1C = 0,051

A1T = 0,061

A2C = 0,176

A2T = 0,194

(A2 - A1)C = 0,176 – 0,051 = 0,125

(A2 - A1)T = 0,194 – 0,061 = 0,133

Fc = 112 = 896

0,125


Ct = 896 x 0,133 = 119 mg/dL

RESULTADOS


Conversão de Unidades (URF/mL para SI)

mmol/L de Colesterol LDL = mg/dL de Colesterol LDL × 0,026



CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade: PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC



Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DESEJÁVEIS

Substituem os valores de referência e são determinadas a partir de dados epidemiológicos, calculados estatisticamente, que relacionam os níveis do colesterol com a prevalência de doença arterial coronariana (DAC).




Colesterol Total

Colesterol HDL

Colesterol LDL

Valor desejável:

< 200 mg/dL


Valor desejável: ≥ 60 mg/dL


Valor desejável:

< 130 mg/dL


Valor limítrofe:

200 a 239 mg/dL




Valor baixo:

< 40 mg/dL


Valor limítrofe:

130 a 159 mg/dL




Valor elevado:

≥ 240 mg/dL



-----------------------




Valor elevado:

≥160




SIGNIFICADO CLÍNICO

As lipoproteínas de baixa densidade (LDL = Low Density Lipoproteins) são as principais proteínas de transporte do colesterol. É a partícula mais aterogênica do sangue, pois contém cerca de dois terços de todo colesterol plasmático. São formadas na circulação a partir das VLDL (lipoproteínas de muito baixa densidade) e provavelmente, pela degradação dos quilomicrons.

A determinação da fração do colesterol ligado à LDL é útil na avaliação do risco de doença coronariana.

O teor de colesterol nas lipoproteínas (LDL e HDL) é considerado como fator de risco para doença arterial coronariana (DAC).

A taxa de Colesterol LDL é portanto, um fator de risco direto com DAC, isto é, quanto maior o seu teor na circulação maior é a probabilidade do indivíduo desenvolver essa doença. Deste modo, valores elevados de Colesterol LDL estão associados com risco aumentado de DAC.

Ao contrário, o Colesterol HDL está relacionado inversamente com o fator de risco, isto é, quanto maior o seu teor na circulação menor o risco de DAC. Deste modo, o colesterol HDL exerce um efeito protetor contra a aterosclerose.

O colesterol juntamente com o fumo, hipertensão e intolerância à glicose são quatro grandes fatores para o desenvolvimento da DAC.



Valores aumentados de LDL são encontrados em diabetes melito, hipotireoidismo, hepatopatias, doença de Cushing, hiperlipoproteinemia do tipo II, síndrome nefrótica, gravidez, mieloma múltiplo, uso de drogas como esteróides anabólicos, anticoncepcionais orais, catecolaminas, corticosteróides glicogênicos, anti-hipertensivos betabloqueadores, carbamazepina.

LINEARIDADE

A reação linear até o valor de 990 mg/dL. Para valores maiores, diluir a amostra com NaCL 150mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.

SENSIBILIDADE ANALÍTICA

O limite de detecção é igual a 0,3 mg/dl, equivalente a média mais dois desvios padrão (DP) obtidos a partir de 20 determinações em uma amostra protéica não contendo colesterol LDL.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Motta VT. Bioquímica Clínica – Princípios e Interpretações 3a Ed – Editora Médica Missau; 2000.

  2. Martinez TLR e Cols. Condutas Clínicas nas Dislipidemias – Health, Belo Horizonte, 1997.

  3. National Cholesterol Education Program Expert Panel. Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATPIII). NIH Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute; 2001.

  4. III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose do Departamento de Aterosclerose da Sociedade Brasileira de Cardiologia – Arquivos Brasileiros de Cardiologia Vol. 77, Suplemento III, Novembro 2001.

  5. Nauck M, Warnick GR, Rifai N. Methods for measurement of LDL-Cholesterol: a critical assessment of direct measurement by homogeneous assays versus calculation. Clin Chem 48: 236-254,2002.

  6. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratry tests, 3th ed. AACC Press, 1997.

  7. LDL DIRETO-PP, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica




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