Enzimologia da Biodegradação



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metodologias


1 – ATIVIDADES DE HEMICELULASES

a) Xilanase

A atividade xilanase (endo-1,4--xilanase) é determinada pela liberação de açúcares a partir do substrato xilana de “birchwood” (Sigma – St. Louis, USA) (BAILEY et al.,1992). Os açúcares redutores liberados durante a reação são determinados pelo método do DNS (MILLER,1959). Os valores de absorbância lidos a 540 m são transformados em moles de xilose por comparação a uma curva padrão de xilose. A atividade enzimática é expressa em moles de produto formado por minuto (Unidades Internacionais, U total), considerando-se o total de unidades obtidas em cada volume de solução de extrato.



Soluções de ensaio

MR

BE

BS
BA

Extrato enzimático (l)

100

100

-

-

Tampão Acetato de Na (l)

(50mM, pH=5,0)



-

900

100

2000

Xilana 1%

900

-

900

-

Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)

1500

1500

1500

3000

(MR=mistura da reação; BE=branco da enzima;BS=branco do substrato e BA= branco do aparelho)

O método consiste em acompanhar a reação de 900 l de xilana a 1% com 100 l de extrato enzimático a 50 C por 5 minutos. A reação é cessada pela adição de 1,5 ml de DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico). O volume final é, então, fervido a 100 C em banho-maria por 5 minutos para que ocorra a reação do açúcar redutor com o DNS.



b) -Xilosidase

Esta atividade é determinada utilizando-se p-nitrofenil--D-xilopiranosídeo (pNPX) (Sigma – St. Louis, USA) como substrato enzimático. O p-nitrofenol liberado após ação da -xilosidase será determinado pela leitura de absorbância a 410 m (Tan et al.,1987). Os valores de absorbância obtidos são transformados em moles de p-nitrofenol liberados em comparação a uma curva padrão de p-nitrofenol. A atividade enzimática será expressa em moles de produto formado por minuto (Unidades Internacionais, U total), considerando-se o total de unidades obtidas em cada volume de solução de extrato.



Soluções de ensaio

MR

BE

BS

Extrato enzimático (l)

200

200

-

Tampão Acetato de Na (l)

(50mM, pH=5,0)



-

800

200

pNPX (0,1%) (l)

800

-

800

Bicarbonato de Na (10%)

2000

2000

2000

O método consiste em acompanhar a reação de 800 l de pNPX (0,1%) com 200 l de extrato enzimático a 50 C por 30 minutos. A reação é cessada pela adição de 2,0 ml de bicarbonato de sódio a 10%.


2 – ATIVIDADES DE CELULASES

  1. Carboximetil celulase

A atividade Carboximetil celulase (CMCase) ou endo-1,4--glucanase é determinada segundo técnica descrita por TANAKA et al. (1981) que consiste em conduzir a hidrólise de uma solução de carboximetilcelulose (Sigma – St. Louis, USA) a 0,44 % em tampão acetato de sódio (50 mM; pH 5,0). A quantidade de açúcares redutores é determinada pelo método do DNS (MILLER,1959). Os valores de absorbância lidos a 540 m são transformados em moles de glicose por comparação a uma curva padrão de glicose. A atividade enzimática é expressa em moles de produto formado por minuto (Unidades Internacionais, U total), considerando-se o total de unidades obtidas em cada volume de solução de extrato.

Soluções de ensaio

MR

BE

BS
BA

Extrato enzimático (l)

100

100

-

-

Tampão Acetato de Na (l)

(50mM, pH=5,0)



-

900

100

2000

Carboximetilcelulose (0,44%)

900

-

900

-

Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)

1500

1500

1500

3000

O método consiste em acompanhar a reação de 900 l de Carboximetil celulose com 100 l de extrato enzimático a 50 C por 60 minutos. A reação é cessada pela adição de 1,5 ml de DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico). O volume final é, então, fervido a 100 C em banho-maria por 5 minutos para que ocorra a reação do açúcar redutor com o DNS.




  1. -glucosidase

Esta atividade é determinada utilizando-se p-nitrofenil--D-glucopiranosídeo (pNPG) (Switzerland) como substrato enzimático. O p-nitrofenol liberado após ação da -glucosidase será determinado pela leitura de absorbância a 410 m (Tan et al.,1987). Os valores de absorbância obtidos são transformados em moles de p-nitrofenol em comparação a uma curva padrão de p-nitrofenol. A atividade enzimática é expressa em moles de produto formado por minuto (Unidades Internacionais, U total), considerando-se o total de unidades obtidas em cada volume de solução de extrato.

O método é o mesmo descrito para a atividade -xilosidase, mas trocando o substrato pNPX por pNPG.



Soluções de ensaio

MR

BE

BS

Extrato enzimático (l)

200

200

-

Tampão Acetato de Na (l)

(50mM, pH=5,0)



-

800

200

pNPG (0,1%) (l)

800

-

800

Bicarbonato de Na (10%)

2000

2000

2000


4.6.3 – ATIVIDADES OXIDATIVAS

a) Lacase

A atividade oxidativa fenoloxidase tipo lacase é determinada utilizando uma solução etanólica de siringaldazina (Sigma – St. Louis, USA) 1,0 mM (525 = 65 mM-1 cm-1) como substrato. A reação de oxidação é conduzida em tampão citrato-fosfato 75 mM, pH 5,0, e o aumento da absorbância, devido à oxidação do substrato, acompanhado durante 10 min no espectrofotômetro (SZKLARZ et al., 1989 - modificado).




Soluções de ensaio

MR

BA


Tampão Citrato-fosfato (l)

(75mM, pH=5,0)



300

300

Solução etanólica de siringaldazina (1 mM)

100

100

Água destilada

100

600

Extrato enzimático

500

-

A atividade é expressa em unidades internacionais por litro (UI/l) de extrato fúngico e calculada pela equação 1.

Δ Abs x 106 x Vf

Atividade (UI/ l) = ( equação 1)

ε x Ve x 1cm



onde, Vf é o volume final de reação e Ve é o volume de extrato enzimático.

  1. Manganês Peroxidase

A atividade manganês peroxidase (MnP) é determinada utilizando uma solução de vermelho de fenol a 0,1% (ε 610 = 22 mM-1cm-1) como substrato fenólico (KUWAHARA et al., 1984).

Soluções de ensaio

Mistura da Reação


Extrato enzimático

5000

Lactato de Sódio 0,25M

1000

Albumina bovina 0,5%

2000

Vermelho de Fenol 0,1%

1000

Sulfato de Manganês 2,0 mM

500


Para preparar o branco do aparelho (BA), deve ser retirado uma alíquota de 950 l da mistura, completar para 1000 l com 50 l do tampão succinato de sódio (20 mM, pH=4,5) e acrescentar 50 l de NaOH 2,0 N. Da mistura restante, será adicionado 400 l de H2O2 2,0 mM para iniciar a reação. A cada minuto de reação será retirada uma alíquota de 1000 l e a reação então cessada com 50 l de NaOH 2,0 N. A leitura é realizada a 610 ηm em um espectrofotômetro. O cálculo da atividade enzimática é feita pela equação 1.

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