ExtraçÃo de dna



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Laboratório de Citogenética e Diversidade Vegetal

Departamento de Biologia Geral, CCB, Universidade Estadual de Londrina

Tel: 43 3371 4509 – Fax: 43 3371-4417 - Campus Universitário

Caixa Postal 6001, CEP: 86.051-990 – Londrina – Paraná - Brasil







Produção de fragmentos de DNA genômico para construção de bibliotecas
O processo de produção de sondas de DNA visando o mapeamento físico por FISH requer procedimentos prévios que iniciam desde o processo de extração de DNA até a seleção de clones. A construção bibliotecas genômicas é fundamental no processo de mapeamento, já que elas serão as fontes das sondas para FISH e sequenciamento.

Quando o DNA genômico vegetal é extraído cuidadosamente, com redução de DNAs de organelas, sem polissacarídeos, proteínas e RNA, este gera uma banda de alto peso molecular em eletroforese (Figura 1). As condições de fragmentação do DNA irão depender do tipo de vetor a ser utilizado na construção da biblioteca. A escolha do vetor (BAC, fosmídio, plasmídio, etc) por sua vez, irá depender do tamanho dos fragmentos a serem clonados. Existem diferentes métodos para fragmentar o DNA, mas, de um modo geral, esses métodos podem ser divididos em químicos e físicos. A fragmentação química usa reagentes que clivam o DNA de modo específico (enzimas de restrição, por exemplo) ou inespecífico (determinados agentes clastogênicos). A fragmentação física, em geral, cliva de modo inespecífico, choque de temperatura, fluxo de DNA por capilares ultrafinos, exposição a calor + pressão e radiação ionizante. Assim, uma vez escolhido o vetor e o tamanho dos fragmentos, há de definir o método e as condições da fragmentação (agente, tempo, etc) para concentrar fragmentos numa faixa de peso molecular desejada.

Alguns Kits de extração de DNA, que usam membranas e filtros, podem fragmentar o DNA devido ao tamanho dos poros por onde o DNA atravessa no processo de purificação. O Kit de extração de DNA vegetal da Qiagen, por exemplo, gera fragmentos aleatórios de 40 Kb, que é exatamente o tamanho ótimo para a produção de uma biblioteca genômica em vetor fosmídio. Neste sentido, a mistura de protocolos pode ser aceita. Supondo que você tenha um DNA genômico extraído por um método convencional (sem Kit) estocado há algum tempo e queira utilizá-lo para obter fragmentos de 40 Kb, é muito mais seguro utilizar a purificação da amostra passando este por uma coluna de um Kit, já que esta vai produzir uma quantidade maior de fragmentos deste tamanho. Muitos kits, como o da Qiagen já mencionado, fornecem a informação sobre o tamanho dos fragmentos gerados.

Se a opção for usar outros métodos físicos como autoclave, sonicador, choque térmico ou fluxo por capilares (hydroshear), certamente muito DNA será gasto até alcançar as condições para obter uma boa quantidade de DNA fragmentado no tamanho desejado. Independente do método empregado, a confirmação somente será obtida por eletroforese pós-fragmentação.


1. Purificação e fragmentação com kit (exemplo para o kit DNeasy Plant Maxi Kit, N. 68163)
Neste caso, é exemplificada a situação de mistura de protocolos onde houve uma extração prévia de DNA para posterior limpeza e purificação. Partindo de uma amostra contendo cerca de 200 ng/L em um volume total de 100 L (20 g), aplique 2 L para teste em eletroforese em agarose a 1% para testar a qualidade da amostra. Este teste irá lhe indicar se há contaminantes e se o DNA está ou não degradado. Após a certificação:


  1. Separe 10 g (50 L da amostra mencionada) e acrescente outros 50 L de água ultra-pura autoclavada;

  2. Adicione 1,5 volumes do tampão AP3 ao DNA genômico (cerca de 10 g de DNA, o qual foi previamente purificado com fenol, clorofórmio, álcool isolamílico, proteinase K e RNAse e está eluído em água ou TE). Precipitados que por ventura forem formados não afetam o procedimento. Homogeneíze a solução;

  3. Transfira a solução para a coluna DNeasy Maxi spin, a qual deverá estar posicionada em um tubo de 50 mL;

  4. Centrifugue a 5000 giros por 5 minutos à temperatura ambiente. Descarte a solução e reutilize o tubo de 50 mL;

  5. Adicione 12 mL do tampão AW diretamente sobre a membrana da coluna. Centrifugue a 5000 giros por 10 minutos. Descarte a solução. Neste passo, é importante secar a membrana, já que o etanol poderá interferir nos passos seguintes;

  6. Transfira a membrana para um novo tubo de 50 mL. Adicione 1 mL do tampão AE diretamente sobre a membrana e deixe por 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugue por 5000 giros por 5 minutos. Adicione novamente 1 mL do tampão AE diretamente sobre a membrana e deixe por 5 minutos à temperatura ambiente. Centrifugue por 5000 giros por 5 minutos.

  7. O DNA purificado está pronto para ser utilizado


Observações


  • Tampão AP1 com coloração amarelada não afeta o procedimento;

  • Todas as etapas de centrifugação são feitas entre 3000 e 5000 giros em temperaturas entre 12 e 25 graus. Use apenas rotos sem oscilação e nunca use rotor de ângulo fixo;

  • Verificar as condições do tampão AP3/E, pois ele pode formar precipitados. Se isto ocorrer, esquente-o à 65 C para dissolver o sal precipitado. Faça isto antes de adicionar o etanol como o kit recomenda. Nunca aqueça este tampão com etanol.

  • Pré-aqueça o tampão AP1 à 65 C. Isto é necessário para o funcionamento do Kit e ajudará a dissolver qualquer precipitado de sal deste tampão.

  • Verifique sempre os tampões AW e AP3/E, pois eles vêm concentrados e, quando utilizados pela primeira vez, necessitam ser dissolvidos em etanol 96-100% PA. LEIA o frasco antes do uso.

  • Pré-aqueça um banho-maria à 65 C


2. Fragmentação do DNA genômico utilizando fluxo por capilar (hydroshear)


  1. Separe 10 g (50 L da amostra mencionada) e acrescente outros 150 L de água ultra-pura autoclavada;

    • Se for usar um Hydroshear automático (por exemplo, GeneMAchine), veja as recomendações de velocidade, abertura do capilar e número de ciclos, como recomendado pelo fabricante (veja o modelo nas figuras 2, 3 e tabela 1). Se for usar o método convencional com seringa (por exemplo, Hamilton 84819), será necessário fazer um teste prévio para número de vezes e intensidade de fluxo de sucção e despejo.

    • Em teoria, uma solução contendo alta concentração de DNA nuclear (sem DNA de organelas) passa por um filamento de modo abrupto, várias vezes. Conforme o fluido concentrado passa pela área de menor diâmetro do filamento (seringa ou máquina), o DNA vai sendo fragmentado. A vantagem do aparelho é que a aceleração do fluido e a taxa volumétrica de fluxo são mantidas constantes através da área menor da concentração (menor diâmetro). Com isso, a força aplicada sobre o fluido naquela espessura de diâmetro faz com que o DNA seja fragmentado pela quebra das ligações químicas de modo mais organizado. Assim, taxa de fluxo e a concentração de DNA no fluido determinam os tamanhos dos fragmentos gerados. Já o método manual (seringa) este controle é perdido e a faixa de fragmentos com um mesmo tamanho não é tão boa quanto com o Hydroshear.








Consistência de quebra após usos repetidos da máquina - eletroforese em gel de agarose 1 a 100V por uma hora.






Efeito da concentração de DNA sobre o tamanho dos fragmentos gerados - eletroforese em gel de agarose 1 a 105V por uma hora.
Tudo indica que quanto menor for o speed code, menores serão os fragmentos gerados:


Speed

3

5, 7 e 9

11


13

15 a 17

Size (pb)

1000 a 2000

1500 a 4000 pb

2500 a 4000

3500 a 6000

Mais de 8000

DNA

SSRs

Elem. intermed. e RE

vários seg e RE

RE



Após a fragmentação os fragmentos poderão ser utilizados no processo de clonagem.



3. Fragmentação do DNA genômico utilizando autoclave


  1. Separe 10 g (50 L da amostra mencionada) e acrescente outros 150 L de água ultra-pura autoclavada;

  2. Feche bem o microtubo, coloque-o em um suporte e acomode-o numa autoclave;

  3. Regule a autoclave para 121 °C (1 atm) e deixe por 5 minutos;

  4. Retire o microtubo da autoclave, deixe alcançar a temperatura ambiente e centrifugue brevemente (spin) para baixar o volume no tubo;

  5. Teste a fragmentação em eletroforese.

4. Fragmentação do DNA genômico utilizando sonicador


  1. Separe 10 g (50 L da amostra mencionada) e acrescente outros 150 L de água ultra-pura autoclavada;

  2. Feche bem o microtubo, coloque-o em um suporte e acomode-o em um sonicador;

  3. Regule o aparelho a 4 °C e em modo “high”, ajuste o tempo para 5 a 10 minutos (a depender do tamanho dos fragmentos), com pulsos de 30 segundos cada, on e off.

  4. Transfira o tubo com as amostras para o gelo;

  5. Teste a fragmentação em eletroforese.


5. Fragmentação do DNA genômico utilizando choque de temperatura


  1. Separe 10 g (50 L da amostra mencionada) e acrescente outros 150 L de água ultra-pura autoclavada;

  2. Feche bem o microtubo, coloque-o em um suporte e acomode-o em frasco com água fervendo e deixe por 5 minutos;

  3. Retire o microtubo da água fervendo e coloque imediatamente do freezer, em contato direto com o gelo, por 5 minutos;

  4. Repita o choque de temperatura por 5 vezes ou mais, a depender do tamanho dos fragmentos desejados;

  5. Transfira o tubo com as amostras para o gelo;

  6. Teste a fragmentação em eletroforese.


6 – Reparo do DNA e eletroforese
Após determinado o método e testadas as condições de fragmentação, o DNA poderá ser utilizado para clonagem. Porém, será necessário reparar as pontas dos fragmentos. Isto pode ser feito antes ou depois da eletroforese para a seleção do trecho em pares de bases que será clonado. Para a reparação prévia, citaremos o protocolo NEB da New England BioLabs (NEB #E6050S):

  1. Misture os seguintes componentes em um tubo de microcentrífuga esterelizado:

    • 5 µg de DNA fragmentado (verifique o volume)

    • NBENext End Repair Reaction Buffer (10 µL)

    • NBENext End Enzyme Mix (5 µL)

    • Complete com água ultra pura autoclavada para um volume final de 100 µL;

  1. Incube em um Termociclador ou banho seco a 20 C por 30 minutos;

  2. Coloque a amostra no gelo e prepare a eletroforese (ver a seguir)

A eletroforese ideal é em gel de agarose LMP 1%, com voltagem baixa (20 a 30 V), durante toda a noite, em um ambiente refrigerado. Se houver uma fonte de pulse Field disponível, a qualidade dos fragmentos separados será mais precisa. Porém, eletroforese convencional também funciona, com uma qualidade um pouco mais baixa, sobretudo quando os fragmentos forem muito grandes, mais que 30 Kb. Faça uma eletroforese limpa, sem brometo, usando agarose nova e tampão TAE ou TBE recém-preparados. Monte o gel seguindo o modelo abaixo. Como o brometo de etídio diminui a eficiência da ligação e, consequentemente da clonagem, seguindo o modelo:



  1. Aplique nos poços 1 e 2 o marcador de peso e 5 µL da amostra reparada;

  2. Deixe um poço vazio (3) e junte três poços com fita adesiva para formar um super poço (4);

  3. Aplique o restante da amostra no poço 4;

  4. Corra a eletroforese nas condições descritas acima. Ao final, recorte a tira dos poços 1 e 2 e core com brometo de etídio;

  5. Verifique o DNA e marque a posição do trecho desejado, comparando com o marcador da canaleta 1;

  6. Retire o gel do transiluminador e posicione-o ao lado do gel não corado. Por comparação, recorte o gel não corado no trecho desejado e coloque o recorte em um tubo para purificação com Kit e continue com a clonagem de acordo com o protocolo do vetor desejado.

OBS: se o objetivo for corar o DNA com Syber Gold ou Green, não haverá problemas com a eficiência da ligação e clonagem. Assim, a eletroforese poderá ser normal. Mas lembre-se que a observação em ultravioleta do transiluminador também diminui muito a eficiência da clonagem.




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