Fosfatase alcalina-pp



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DA AMILASE

Página de 5

POPBIO 009

Revisão: 00




AMILASE DIRETA CNP
FUNDAMENTO

A -amilase hidrolisa o substrato de α-2-cloro-4-nitrofenil-β-1,4-galactopiranosilmaltoside (Ga–G2-α-CNP) liberando 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) e 1,4-galactopiranosilmaltoside (Gal-G2).

A velocidade de formação do 2-cloro-4-nitrofenol (CNP) de cor amarela é medida fotometricamente em 405 nm, possibilitando uma determinação direta da atividade da amilase na amostra analisada.

APLICAÇÃO CLÍNICA

A dosagem da amilase no soro é empregada principalmente para avaliar as seguintes patologias: pancreatite aguda primária, pancreatite crônica recidivante, úlcera péptica perfurada, perfuração de intestino, parotidite (caxumba), cetoacidose diabética, obstrução duodenal, colecistite aguda, gravidez ectópica e insuficiência renal


AMOSTRA

Preparo do Paciente

Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.

Urina: Colher a amostra com intervalos determinados de 2 ou até 24 horas.

Amostras utilizadas


Soro, Plasma (heparina), Urina e outros Líquidos Biológicos (ascítico, duodenal e pleural).

As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2-8°C. Não adicionar preservativo.



Estabilidade e armazenamento da amostra

A enzima no soro ou plasma é estável por um mês entre 2-8°C.

Na urina, a estabilidade é também de um mês, desde que o pH seja ajustado para 7,0.

Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).



Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).



Critérios para rejeição da amostra

Não usar amostras com sinais de contaminação bacteriana.



Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

AMILASE DIRETA CNP CAT. 407 MS 80022230070

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil

Farmacêutico Responsável: Homero Jackson de Jesus Lopes CRF – MG - 2010


Componentes do kit

Conservar entre 2-8C.



1. Substrato - Contém tampão 50 mmol/L; cloreto de sódio 300 mmol/L, tiocianato de sódio 900 mmol/L; cloreto de cálcio 5 mmol/L; α-2-cloro-4-nitrofenil-β-1,4-galactopiranosilmaltoside (Ga-G2-α-CNP) 3 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
Estabilidade

O Substrato está pronto para uso e é estável até a data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservado na temperatura recomendada, bem vedado e se evite a contaminação durante o uso.



Sinais de Deterioração do Reagente


1- A presença de partículas, turbidez e absorção do Branco acima de 0,300 em 405 nm indicam deterioração do reagente.

2- Elevações repentinas da absorbância do Substrato indicam contaminação com saliva ou suor.




Precauções e Cuidados Especiais

1- Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

2- Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

3- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

4- O Substrato (1) contém azida sódica como conservante. Evitar contato com os olhos, pele e mucosa. Contém também tiocianato de potássio que é venenoso. Não aspirar ou ingerir.

5- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.


Atenção:

Saliva e suor contêm amilase. Para evitar possível contaminação não pipetar com a boca, não soprar pipetas e evitar o contato do reagente e pipetas com a pele.



EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

  • Espectrofotômetro com cubeta termostatizada;

  • Tubos e Pipetas;

  • Cronômetro.


Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.


Procedimento em Analisadores Automáticos

Mencionar o manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes para o sistema automático.


Interferências


A bilirrubina até 20 mg/dL, lipemia ( triglicérides até 1800 mg/dL), hemólise ( hemoglobina até 180 mg/dL) não interferem nos resultados.

Amostras com valores de triglicérides acima de 1800 mg/dL produzem interferências negativas.

A morfina, álcool e medicamentos colinérgicos produzem resultados falsamente elevados da amilase sérica.

Valores falsamente elevados de amilase no soro com amilase urinária normal podem ocorrer pela presença da macroamilase no sangue.

A macroamilase resulta da complexação da amilase do soro com proteínas de alto peso molecular.
PROCEDIMENTO

Procedimento Manual

A- Condições de Reação


Leitura: Comprimento de onda 405 nm (400 a 410 nm)

Temperatura: 37ºC

Tipo de Reação: Cinética contínua crescente.

B- Técnica de Análise

Dosagem no Soro


1- Pipetar na cubeta ou tubo:


Substrato

1000 L

Amostra

20 L

2- Homogeneizar, inserir a cubeta no porta-cubetas termostatizado a 37°C e acionar o cronômetro.

3- Após 1 minuto, fazer a leitura da absorbancia inicial.

4- Fazer novas leituras de absorbância, após exatamente 1,2 e 3 minutos.

5- As diferenças entre as absorbâncias devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método.

6-Calcular o acréscimo de absorbância médio por minuto (∆A/ minuto médio).



CÁLCULOS

Ver linearidade

Considerando que o coeficiente de absorção milimolar do cloronitrofenol (CNP) em 405 nm é 12,9 deduz-se a seguinte fórmula para calcular a atividade catalítica da amilase:

U/L de amilase em 405 nm = ∆A/minuto × 3953

Onde: ∆A/minuto = Variação média da absorbância por minuto

O fator 3953 é calculado com base nas condições da reação cinética contínua. Esse fator deve ser recalculado sempre que se fizer qualquer modificação nos parâmetros da reação. Ver método para cálculo do fator.

Exemplo

Se A/min médio do teste = 0,025 (média)

Atividade de amilase em U/L = A teste × 3953

Atividade de amilase = 0,025 × 3953 = 99 U/L


Cálculo do Fator

Fator = (Vt × 1000) ÷ ( Є × Va × d)

Vt = volume total do ensaio (1020 µL)

Va = volume da amostra (20 µL)

1000 = conversão de U/mL para U/L

d = espessura da cubeta, via da luz (1cm)

Є = Absortividade milimolar do CNP em 405 nm = 12,9

Fator = (1020 × 1000) ÷ (12,9 × 20 × 1 ) = 3953


Dosagem na urina

A- Coleta e preparo da amostra

Instruir o paciente para coletar corretamente a urina no periodo de tempo estipulado pelo médico.

Geralmente, utiliza-se a urina coletada em um determinado número de horas. Exemplo: urina de 2 horas.

Homogeneizar, medir e anotar o volume urinário em mL.

Anotar também o tempo de coleta da amostra.
B- Dosagem e cálculos

Seguir o mesmo procedimento técnico e cálculos do soro/ plasma.

Calcular o resultado em Unidades de Amilase/hora (U/h).
Unidades de Amilase Urinária/hora = U/h

Amilase Urinária (U/h) = (Amilase U/L × V) ÷ (H × 1000)

V = volume da urina em mL

H = número de horas em que foi coletada a urina


Exemplo

Se Amilase urinária (valor encontrado na dosagem) = 88 U/L

Se V = Volume da urina em mL = 186 mL

Se H = n° de horas em que foi coletada a urina = 2h

Amilase Urinária (U/h) = (88 × 186) ÷ (2 × 1000) = 8 U/h
Relação Amilase/ Creatinina na Urina (U/g)

U/g = (amilase em U/L × 100) ÷ (creatinina em mg/dL)


Dosagem em outros Líquidos Biológicos

Seguir o mesmo procedimento do soro/plasma.

Verificar a necessidade de diluição da amostra.
Relação Clareamento Amilase/ Clareamento Creatinina

Na maioria dos casos de pancreatite aguda, ocorrrem elevações concomitantes da amilase sérica e urinária, mas em certos casos a elevação da amilase urinária não é acompanhada por uma elevação paralela da amilase sérica. Portanto, a relação entre a depuração ou clareamento da amilase e a depuração ou clareamento da creatinina, expressa em porcentagem, proporciona maior valor diagnóstico nos casos de pancreatite aguda e pancreatite recorrente.

Determinar a atividade da amilase e a concentração da creatinina nas amostras de soro e urina e aplicar os resultados na seguinte fórmula:
% Relação CA/CC = (AmU U/L × CrS mg/dL) ÷ ( AmS U/L × CrU mg/dL) × 100

CA = Clareamento de Amilase

AmU = Amilase na Urina

AmS = Amilase no Soro

CC = Clareamento de Creatinina

CrS = Creatinina no Soro

CrU = Creatinina na Urina
Atenção

• Esta técnica de dosagem é adequada para fotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor do que 1000 µL.

• O analista sempre deve fazer uma verificação de necessidade de ajuste do volume para fotômetro empregado no sue laboratório.

• Os volumes de amostra e de reagente podem ser modificados proporcionalmente, sem alterar o desempenho do teste e os cálculos.

• Em caso de redução dos volumes é necessário observar o volume mínimo de leitura fotométrica.

• Volumes da amostra menores do que 10 µL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição.



RESULTADOS


Não Aplicável

CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade : PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC



Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DE REFERÊNCIA



Soro ou plasma


25 a 125 U/L


Urina ( Amilase urinária/hora)




Até 30 U/h



Relação Amilase / Creatinina na Urina


Até 400 U/g

Relação de clareamento da amilase por clareamento da creatinina




De 1 a 4%


Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.



SIGNIFICADO CLÍNICO

A amilase é uma hidrolase normalmente secretada pelas células acinares do pâncreas para o ducto pancreático e deste para o duodeno. No intestino, a amilase hidrolisa os carbohidratos em seus componentes, os açúcares. Quando ocorre uma lesão das células acinares como na pancreatite, ou ocorrendo uma obstrução no fluxo do ducto pancreático como no carcinoma pancreático, a amilase fluirá para o sistema linfático intrapancreático e peritoneo e, por drenagem, atingirá os vasos sanguíneos em concentração elevada. A amilase alcançará um aumento anormal dentro de 12 a 24 horas após o início da doença, sendo rapidamente clareada pelos rins, atingindo os níveis normais em 48 a 72 horas.

Nos casos de pancreatite persistente, obstrução dos ductos pancreáticos e pseudocisto pancreático, os níveis de amilase no soro estarão persistentemente aumentados.

Muito embora a dosagem da amilase seja um teste sensível para diagnóstico de doenças pancreáticas, ela não é específica. Outras doenças não pancreáticas podem elevar os níveis de amilase no soro como na perfuração do intestino, na úlcera péptica penetrante para o pâncreas, na obstrução duodenal e nas parotidites (caxumba) devido à amilase salivar.

Casos de cetoacidose diabética e de gravidez ectópica podem apresentar também níveis altos de amilase no soro.

A determinação da amilase na urina, assim como a dosagem no soro, também não é específica para as doenças pancreáticas. Outras doenças, tais como parotidite (caxumba), colecistite, perfuração de intestino, úlcera péptica penetrante, gravidez ectópica e infarto renal podem apresentar amilase urinária elevada. Contudo, nas pancreatites a taxa de amilase na urina estará sempre elevada.

Algumas drogas como etanol, narcóticos e colinérgicos aumentam a amilase por efeito fisiológico. Outras como citrato, oxalato e fluoreto diminuem a amilase por interferência química.

Para um diagnóstico mais seguro de pancreatite é importante, juntamente com a dosagem da amilase sérica e urinária, determinar a Relação entre o Clareamento da Amilase e o Clareamento da Creatinina. Quando a Relação Clareamento Amilase/Clareamento Creatinina é igual a 5% ou mais, o diagnóstico de pancreatite pode ser feito com segurança. Quando a Relação é menor do que 5% em um paciente apresentando níveis elevados de amilase no soro e na urina, indica uma condição patológica não pancreática (macroamilasemia, perfuração de intestino, etc).

Valores elevados: As patologias que mais comumente apresentam valores altos de amilase são: pancreatite aguda primária, pancreatite crônica recidivante, úlcera péptica perfurada, perfuração de intestino, parotidite (caxumba), cetoacidose diabética, obstrução duodenal, colecistite aguda, gravidez ectópica e insuficiência renal.

LINEARIDADE

Linearidade

A reação é linear até 2000 U/L. Para valores maiores, diluir a amostra com solução de NaCL 150 mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.



LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Balsells D, Gella FG, Gubem G, Canalias F. Reference values for -amylase in human serum and urine using 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltotriose as substrate. Clin. Chim. Acta 274:213-217,1998.

  2. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Fundamento de Química Clínica, 4a Ed- Guanabara Koogan 1998.

  3. Gella FG, Gubem G, Vidal R, Canalias F. Determination of total and pancreatic -amylase in human serum with 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltotriose as substrate. Clin. Chim. Acta 259:147-160, 1997.

  4. Lopes HJJ. Enzimas no Laboratório Clínico – Aplicações Diagnósticas. Belo Horizonte – Analisa Diagnóstica, 2000.

  5. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratry tests, 4th ed. AACC Press, 1995.

  6. AMILASE DIRETA CNP, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica




Nome

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Data

Elaborado por:







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Revisado por:







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Desativado por:







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Razão:







Número

Destino

Cópias








Revisão 04/11

Liberado Homero

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