Fosfatase alcalina-pp



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DA CK TOTAL

Página de 4

POPBIO 021

Revisão: 00




CK-NAC-PP
FUNDAMENTO

A creatino quinase (CK) catalisa a reação entre creatina fosfato e adenosina difosfato (ADP) formando creatina e adenosina trifosfato (ATP).

Em sequência, a glicose é fosforilada pelo ATP sob a ação da hexoquinase (HK) formando glicose-6-fosfato, que é oxidada a 6-fosfogluconato (6-PG) pela glicose-6-fosfato-desidrogenase (G-6-PDH) na presença de NADP+. Uma quantidade equimolar de NADP+ é reduzida a NADPH, havendo um aumento da absorbância em 340 nm proporcional à atividade da CK.





APLICAÇÃO CLÍNICA

A dosagem da CK Total tem aplicação no diagnóstico das seguintes patologias: Infarto agudo do miocárdio, distrofia muscular, infarto pulmonar, doença vascular cerebral aguda, convulsões, poliomiosite e trauma do sistema nervoso central.


AMOSTRA

Preparo do Paciente

Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.


Amostras utilizadas


Soro ou Plasma (EDTA ou heparina). Evitar exposição á luz solar intensa.

Estabilidade e armazenamento da amostra

A enzima no soro ou plasma é estável por 7 dias entre 2-8 C.



Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).



Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).



Critérios para rejeição da amostra

Não usar amostras hemolisadas e nem com sinais de contaminação bacteriana.



Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

CK-NAC-PP CAT. 458 MS 80022230088

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil

Farmacêutico Responsável: Homero Jackson de Jesus Lopes CRF – MG - 2010


Componentes do kit

Conservar entre 2-8 C.



1- Tampão - Contém tampão imidazol 125 mmol/L, acetato de magnésio 12,5 mmol/L, N-acetilcisteína 25 mmol/L, hexoquinase 5000 U/L, glicose-6-fosfato desidrogenase 3500 U/L, NADP 2,5 mmol/L, AMP 6,25 mmol/L, ADP 2,5 mmol/L, diadenosinapentafosfato 12,5 µmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
2- Substrato – Contém tampão, creatinofosfato 150 mmol/L, glicose 100 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
3- Calibrador (liofilizado) – Contém tampão 50 mmol/L, cloreto de sódio 154 mmol/L, CKMB e CKMM de origem humana. O valor da atividade de CKMB está indicada no rotulo do frasco, que é rastreável ao Procedimento Primário de Referencia da IFCC e ao Material de Referencia ERM – AD455/IFCC.
Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.


Precauções e Cuidados Especiais

1- Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

2- Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

3- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

4- O Calibrador (3) por ser derivado do sangue humano foi testado para anticorpos anti-HCV e anti-HIV e antígeno HBsAg e apresentou resultado negativo. No entanto, deve ser tratado com precaução, como potencialmente infectante. Manusear e descartar segundo as normas de biossegurança.

5- O Tampão (1) e o Substrato (2) contêm azida sódica como conservante. Evitar contato com os olhos, pele e mucosa. Não aspirar ou ingerir.

6- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.

EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

• Espectrofotômetro UV com cubeta termostatizada;

Tubos e Pipetas;

• Cronômetro.



Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.


Influências Pré-Analíticas


A atividade de CK total pode aumentar até 5 vezes após injeções intramusculares.

A atividade da CK total pode aumentar até 3 vezes ou mais após exercícios físicos.

O uso prolongado do torniquete pode produzir resultados falsamente elevados de CK total.

Interferências


A bilirrubina até 38 mg/dL, lipemia (triglicérides até 1000 mg/dL) e hemólise (hemoglobina até 120 mg/dL) não produzem interferências significativas.

Amostras hemolisadas com hemoglobina acima de 120 mg/dL produzem interferência positiva significativa.

Amostras com triglicérides acima de 1000 mg/dL produzem resultados falsamente diminuídos.
Preparo do Reagente de Trabalho

1- Preparo do Reagente deTrabalho

De acordo com o consumo, misturar suavemente os reagentes 1 e 2 na seguinte proporção: 4 volumes de Tampão (1) + 1 volume do Substrato (2). Estável por 14 dias entre 2-8 ºC protegido da luz.
2- Preparo do Calibrador

• Abrir cuidadosamente o frasco de Calibrador (3).

• Usando uma pipeta volumétrica calibrada, adicionar ao frasco do Calibrador o volume de água tipo II indicado no rótulo do frasco.

• Fechar o frasco com a tampa de borracha e deixar em repouso por 10 minutos.

• Homogeneizar suavemente por inversão para dissolver o liofilizado.

• Antes de usar, homogeneizar novamente e retirar a quantidade necessária para uso.

• Tampar imediatamente e armazenar bem vedado e protegido da luz.

• Estável por 30 dias entre 2-8°C.

• O Calibrador dissolvido deverá ser mantido fora da temperatura recomendada somente pelo tempo mínimo para retirada do volume de análise.

• Para aumentar o período de conservação do Calibrador para 90 dias, sugerimos utilizar criotubos, dividir o volume em alíquotas menores e armazenar em temperatura inferior a 10 ºC negativos.


Nota

O Desempenho do Calibrador pode ser afetado por vários fatores como: erros de reconstituição, de homogeneização, armazenamento incorreto, contaminação da água ou vidraria.


PROCEDIMENTO

A – Condições de Reação

Leitura: Comprimento de onda 340 nm

Temperatura: 370C

Tipo de reação: Cinética contínua crescente


Procedimento Manual

B - Técnica de Análise com Calibrador

1- Pipetar na cubeta ou tubo:



Reagente de Trabalho

1000 µL

Amostra ou Calibrador

20 µL

2- Homogeneizar, inserir no porta-cubetas termostatizado e acionar o cronômetro.

3- Após 2 minutos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras após exatamente 1, 2 e 3 minutos.

4- As diferenças entre absorbâncias (ΔA/minuto) devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método.

5- Calcular o aumento médio de absorbância por minuto do Calibrador e do Teste (ΔA/minuto médio).


CÁLCULOS

Ver Linearidade.

Como a metodologia obedece à lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do Fator de Calibração (FC).

ΔA/minuto médio = Variação média da absorbância por minuto.

AC = Atividade de CK do Calibrador = x U/L (Ver valor de CK no rótulo do frasco de Calibrador)

AT = Atividade de CK do Teste em U/L = ΔA/minuto do Teste x FC

FC = AC ÷ ΔA/minuto médio do Calibrador
Exemplo

Se ΔA/minuto médio do Calibrador = 0,036

Se ΔA/minuto médio do teste = 0,012

Se AC = 286 U/L

FC = AC ÷ ΔA/minuto médio do Calibrador = 286 ÷ 0,036 = 7944

AT = Atividade de CK do Teste em U/L = 0,012 x 7944 = 95 U/L


C - Técnica de Análise sem Calibrador

1- Pipetar na cubeta:



Reagente de Trabalho

1000 µL

Amostra

20 µL

2- Homogeneizar, inserir no porta-cubetas termostatizado a 37°C e acionar o cronômetro.

3- Após 2 minutos, anotar a absorbância inicial e efetuar novas leituras após exatamente 1, 2 e 3 minutos.

4- As diferenças entre absorbâncias (ΔA/minuto) devem ser praticamente iguais, indicando a linearidade do método.

5- Calcular o aumento médio de absorbância por minuto para o Teste (ΔA/minuto médio).


Cálculos

Ver Linearidade.

Considerando que o coeficiente de absorção milimolar do NADPH em 340 nm é 6,3 deduz-se a seguinte fórmula para calcular a atividade catalítica:

U/L de CK Total = ΔA/minuto médio x 8095

ΔA/minuto = Variação média da absorbância por minuto.

Exemplo

Se ΔA/minuto médio do Teste = 0,012

U/L de CK total = 0,012 x 8095

U/L de CK total = 97 U/L


Cálculo do Fator

Fator = (Vt x 1000) ÷ (ε x Va x d)

Vt = Volume total do ensaio = 1020 µL

Va = Volume de amostra = 20 µL

1000 = Conversão U/mL para U/L

d = espessura da cubeta, via da luz (1 cm)

e = absorbância milimolar do NADPH em 340 nm = 6,3

Fator = (1020 x 1000) ÷ (6,3 x 20 x 1) = 8095


Atenção

• As técnicas apresentadas são adequadas para fotômetros cujo volume mínimo de solução para a leitura é igual ou menor que 1000 µL.

• O analista sempre deve fazer uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro empregado no seu laboratório.

• Os volumes de amostra e de reagente podem ser modificados proporcionalmente, sem alterar o desempenho do teste e os cálculos. Em caso de redução dos volumes é necessário observar o volume mínimo de leitura fotométrica.

• Volumes da amostra menores do que 10 µL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados com cautela porque aumentam a imprecisão da medição.

RESULTADOS


Unidade convencional (U/L) × 0,0167 = Unidade SI (µKat/L)

CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade : PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC


Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.

VALORES DE REFERÊNCIA

Homens: 26 a 189 U/L

Mulheres: 26 a 155 U/L

Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.



SIGNIFICADO CLÍNICO

A creatina quinase (CK ou CPK) é encontrada no músculo cardíaco, na musculatura esquelética e no cérebro. Deste modo, qualquer lesão nas células desses órgãos provocará um aumento nos níveis séricos de CK. De acordo com a literatura, a enzima encontra-se aumentada numa faixa de 65-100% dos pacientes com infarto agudo do miocárdio. No infarto do miocárdio, a CK comporta-se de modo semelhante à AST, porém as doenças hepatocelulares que produzem elevações da AST não exercem nenhum efeito sobre a CK. Os valores de CK no soro podem estar alterados em várias condições clínicas associadas a lesão muscular aguda ou a esforço muscular intenso. Portanto, os níveis de CK encontram-se normalmente altos na miosite, distrofia muscular, traumatismo muscular, após exercício moderadamente intenso, após cirurgia e no delirium tremens ou nas convulsões. Níveis altos de CK podem ser encontrados nos casos de alcoolismo acentuado, devido ao efeito do álcool sobre os músculos. A CK encontra-se também quase sempre elevada após injeções intramusculares.

Em relação ao diagnóstico do infarto do miocárdio, a dosagem da CK total apresenta alguns inconvenientes a saber:

a- falta de especificidade, devido a elevações falso-positivas em consequência de lesão dos músculos esqueléticos, principalmente nas injeções intramusculares.

b- período de tempo relativamente curto em que a enzima permanece alta após o início do infarto.



Isoenzimas da Creatina-Quinase (CK): A CK total pode ser separada em 3 frações principais, denominadas de CK-BB (CK-1), CK-MB (CK-2) e CK-MM (CK-3). Atualmente, os laboratórios já podem dispor de métodos adequados para a determinação das isoenzimas da CK.

Valores elevados de CK Total: Infarto agudo do miocárdio, distrofia muscular, delirium tremens, infarto pulmonar, doença vascular cerebral aguda, convulsões, alcoolismo crônico, poliomiosite, choque elétrico, hipocalemia, dermatomiosite e trauma do sistema nervoso central.

Valores elevados da Isoenzima CK-BB: Infarto pulmonar, lesão cerebral, acidente vascular cerebral, choque, embolia pulmonar, hemorragia subaracnóide e câncer no cérebro.

Valores elevados da Isoenzima CK-MM: Distrofia muscular, miosite, convulsões recentes, cirurgia recente, hipotireoidismo, hipocalemia, injeções intramusculares, e delirium tremens.

Valores elevados da Isoenzima CK-MB: Infarto agudo do miocárdio, defibrilação cardíaca, isquemia cardíaca, miocardite, cirurgia de aneurisma cardíaco, distrofia muscular e rabdomiólise.

LINEARIDADE

Linearidade

A reação é linear até 2000 U/L. Para valores maiores, diluir a amostra com solução de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e realizar uma nova determinação. Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.



SENSIBILIDADE ANALÍTICA

O limite de detecção é igual a 6,2 U/L, equivalente a três desvios padrão (DP) obtidos a partir de 20 determinações de CK em uma amostra de soro de 117 U/L.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Fundamento de Química Clínica, 4a Ed - Guanabara Koogan SA; 1998.

  2. IFCC. Acta Bioq Clin Latino Americana 1987;21:281.

  3. IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. JIFCC 1989; 1:130-139.

  4. Lopes HJJ. Enzimas no Laboratório Clínico-Aplicações Diagnósticas. Belo Horizonte, Analisa Diagnóstica, 1998.

  5. Sociedad Española de Química Clínica, Comisión de Enzimas. Quim Clin 1988; 7:29-32.

  6. CK-NAC-PP, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica







Nome

Assinatura

Data

Elaborado por:







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Aprovado por:







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Implantado por:







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Substitui POP:




Revisado por:







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Revisado por:







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Revisado por:







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Desativado por:







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Razão:







Número

Destino

Cópias








Revisão 04/11

Liberado Fernanda

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