Fosfatase alcalina-pp



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Procedimento Operacional Padrão

DOSAGEM DA FOSFATASE ALCALINA

Página de

POPBIO 031

Revisão: 00




FOSFATASE ALCALINA
FUNDAMENTO

A fosfatase alcalina do soro hidrolisa o substrato de timolftaleína monofosfato, liberando timolftaleína e fosfato inorgânico. Pela adição de álcali, a ação enzimática é inibida e a timolftaleína adquire cor azul, cuja absorbância é medida fotometricamente.

A cor do produto final da reação é resultante da mistura de cor azul e a cor própria do substrato.
APLICAÇÃO CLÍNICA

A dosagem da Fosfatase Alcalina no soro é empregada principalmente para avaliar doenças hepáticas (hepatites, cirrose, câncer, icterícias obstrutivas) e doenças ósseas.


AMOSTRA

Preparo do Paciente

Colher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.



Amostras utilizadas

Soro ou Plasma (heparina).



Estabilidade e armazenamento da amostra

O analito é estável por 7 dias entre 2-8C.



Volume ideal utilizado para análise

(Definir o volume ideal a ser encaminhado para análise).



Volume mínimo utilizado para análise

(Definir o volume mínimo a ser encaminhado para análise).



Critérios para rejeição da amostra

Fazer referência ao manual ou POP de coleta, separação e distribuição de material.
REAGENTE UTILIZADO

FOSFATASE ALCALINA CAT. 340 MS 80022230142

GOLD ANALISA DIAGNÓSTICA LTDA

CNPJ – 03.142.794/0001-16

Av. Nossa Senhora de Fátima, 2363

Belo Horizonte – MG – Brasil
Farmacêutico Responsável: José Gilmar Pereira Berto - CRF-MG 13421
Componentes do kit

Conservar em temperatura ambiente (15-25°C).



1- Padrão - Contém timolftaleína equivalente a 45 U/L.
2- Substrato - Contém timolftaleína monofosfato de magnésio 22 mmol/L. Não refrigerar.

3- Tampão - Contém tampão 300 mmol/L pH 10,1.
4- Reagente de Cor - Contém hidróxido de sódio 250 mmol/L e carbonato de sódio 94 mmol/L.
Notas

  1. O Substrato (2) poderá apresentar turvação ou precipitado, fato que não interfere na sua eficácia. Agitar antes de usar.

  2. Manter os frascos do Padrão (1) e do substrato (2) bem vedados para evitar a evaporação dos solventes.

  3. O Tampão (3) deve ser mantido aberto o menor tempo possível, para não ser contaminado com CO2 atmosférico. Não soprar dentro do frasco para evitar alteração do pH da solução pela introdução de CO2.



Estabilidade

Os reagentes são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados na temperatura recomendada, bem vedados e se evite a contaminação durante o uso.


Precauções e Cuidados Especiais

  1. Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.

  2. Recomendamos o uso das Boas Práticas de Laboratórios Clínicos para a execução do teste.

  3. De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.

  4. O Reagente de Cor (4) é corrosivo. Contato com os olhos, pele ou mucosas devem ser evitados. Não aspirar ou ingerir.

  5. Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.



EQUIPAMENTOS


Procedimento Técnico Manual

  • Espectrofotômetro (leitura em 590 nm);

  • Banho – Maria ou termostatizador na temperatura constante de 37°C;

  • Pipetas e tubos;

  • Cronômetro.


Procedimento Técnico Automatizado

Citar nome, modelo e o local onde se encontra o equipamento; Fazer referência ao manual ou POP para utilização do mesmo.


Procedimento Técnico Alternativo

Citar o equipamento alternativo e os procedimentos para medição dos ensaios. Indicar as possíveis diferenças quando os procedimentos manuais substituírem os procedimentos automatizados.


Procedimento em Analisadores Automáticos

Mencionar o manual ou POP para utilização do equipamento analítico. Anexar o guia de aplicação dos reagentes para o sistema automático.


Influências Pré-Analíticas

Glicose e glicerol aumentam a atividade da enzima, atuando como aceptores de fosfatos.

Citrato, oxalato, EDTA e fluoreto inibem a atividade da Fosfatase alcalina por formarem complexos com o magnésio, que é um importante ativador da enzima.
Interferências

A bilirrubina até 38 mg/dL ( triglicérides até 250 mg/dL) e hemólise (hemoglobina até 30 mg/dL) não produzem interferências significativas.

Hemólises mais acentuadas produzem resultados falsamente diminuídos. Valores de triglicérides acima de 250 mg/dL produzem resultados falsamente elevados por interferência fotométrica. Nestes casos, empregar um Branco de Amostra.
Branco de Amostra

Misturar 50 µL da amostra com 2,5 mL de solução de NaCL 150 mmol/L (0,85%). Medir a absorbância em 590 nm, acertando o Zero com água deionizada/ destilada. Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular atividade enzimática.



PROCEDIMENTO


Procedimento Técnico Manual

A- Condições de Reação


Leitura: Comprimento de onda 590 nm

Medida: Contra o Branco da reação

Tipo de reação: Cinética de tempo fixo


B- Dosagem no Soro ou Plasma


1-Identificar três tubos de ensaio Branco, Teste e Padrão e proceder:


Tubos

Branco

Padrão

Teste

Substrato (2)

50 L

50 L

50 L

Tampão (3)

500 L

500 L

500 L

Padrão (1)

--------

50 L

-------

2-Homogeneizar e incubar os tubos em banho-maria a 37°C por 2 minutos.

O nível da água do banho-maria deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos.

Não retirar os tubos do banho- maria para adicionar a amostra.


Soro

--------

---------

50 L

3-Homogeneizar e Incubar a 37ºC por 10 minutos (CRONOMETRAR)

Reagente de Cor (4)

2,0 mL

2,0 mL

2,0 mL

4-Homogeneizar e fazer as leituras fotométricas em 590nm ou em filtro laranja (580 a 590nm), acertando o zero com o Branco.

A cor é estável por 120 minutos.


CÁLCULOS

Ver Linearidade.

AT = Absorbância do Teste

AP = Absorbância do Padrão

CP = Concentração do Padrão = 45 U/L

Como a metodologia obedece a Lei de Lambert-Beer, fazer os cálculos através do Fator de Calibração.

FC = CP ÷ AP

CT = FC x AT


Exemplo


AP = 0,372 AT = 0,420 CP = 45U/L

FC = CP  AP = 45  0,372 = 121

CT = FC × AT = 121 × 0,420 = 50, 8 = 51U/L

RESULTADOS

Unidade de Medida

U/L


Definição de Unidade: Uma unidade é igual a quantidade de enzima que libera por hidrólise 1 micromol de timolftaleína por minuto, por litro de soro nas condições do teste.
Atenção

• O analista sempre deve fazer uma verificação da necessidade de ajuste do volume para o fotômetro empregado no seu laboratório.

• Os volumes de amostra e de reagente podem ser modificados proporcionalmente, sem alterar o desempenho do teste e os cálculos.

• Em caso de redução dos volumes é necessário observar o volume mínimo de leitura fotométrica.



CONTROLE DA QUALIDADE

Materiais

Identificar os materiais de controle interno e externo da qualidade, citando fabricante e número de catálogo.

Referenciar POP para limpeza e secagem dos materiais utilizados.

Controle Interno

Descrever a calibração periódica de pipetas, equipamentos utilizados, controle de temperatura ambiente e geladeiras para armazenamento dos kits.

Citar a utilização de soros controles (nível normal –código --------- e patológico –código -------) nas análises realizadas juntamente com a freqüência da utilização dos mesmos. Descrever o procedimento de verificação de novos lotes de controles e reagentes.

Citar POP para controle interno.



Controle Externo

Descrever os procedimentos utilizados nas avaliações de qualidade feitas por programas de comparação entre laboratórios ou outros controles de qualidade : PNCQ-SBAC e/ou PELM-SBPC



Gerenciamento dos dados obtidos no Controle Interno e Externo

Definir como os dados de controle são arquivados e gerenciados.

Fazer referência ao manual ou POP de garantia da qualidade.


VALORES DE REFERÊNCIA (37C)


Os valores de referência variam em função da idade.

Soro ou Plasma

1-Adultos: 13 a 43 U/L

2-Crianças até 12 anos: 56 a 156 U/L.
Estes valores devem ser usados como uma orientação. É recomendado que cada laboratório estabeleça seus próprios valores de referência.
SIGNIFICADO CLÍNICO

A fosfatase alcalina compreende um grupo de enzimas fosfohidrolases que apresentam atividade máxima em pH alcalino, próximo de 10. A enzima é encontrada em vários tecidos, com maiores concentrações no fígado, no epitélio do trato biliar e no osso. A mucosa intestinal e a placenta contêm também a fosfatase alcalina. A fosfatase alcalina apresenta várias isoenzimas, sendo que cada uma das fontes produtoras contém uma isoenzima específica. O fracionamento das isoenzimas da ALP é útil para diferenciar doenças ósseas de doenças hepáticas. As isoenzimas são melhor estudadas pelo teste de estabilidade ao calor e pelo fracionamento eletroforético. A isoenzima de origem hepática (ALP1) é termo-estável, enquanto que fração óssea (ALP2) é inativada pelo calor.

A determinação laboratorial da fosfatase alcalina (ALP) se aplica muito bem para o diagnóstico de doenças do fígado e dos ossos.

Valores elevados: Cirrose, obstrução biliar intra e extra-hepática, tumor primário ou metastático do fígado, tumor metastático do osso, recuperação de fraturas ósseas, doença de Paget, hiperparatireoidismo, fases de crescimento normal dos ossos.

Valores Diminuídos: Hipotireoidismo, hipofosfatemia, desnutrição, doença celíaca.
LINEARIDADE

A reação é linear até 500 U/L com cinética de ordem zero.

Para valores de absorbância acima de 2,0 proceder da seguinte maneira:

a) Diluir o conteúdo dos tubos Teste e o Branco com o Reagente de Cor (4),

b) Efetuar nova leitura fotométrica,

c) Multiplicar o valor obtido pelo fator de diluição empregado.

Se o valor for ainda maior que 500 U/L:


  1. Repetir o ensaio reduzindo o tempo de incubação após a adição da amostra para 2 minutos.

  2. Multiplicar o valor obtido por 5.



SENSIBILIDADE ANALÍTICA

O limite de detecção é igual a 0,125 U/L, equivalente a uma absorbância de 0,001 utilizando a absorbância do Padrão como parâmetro.


LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Os resultados deverão ser usados em conjunto com informações disponíveis da avaliação clínica e outros procedimentos diagnósticos.



REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Amador, E.: J.A.M.A., 185, 431, 1970.

2- Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook Clinical Chemistry. Philadelphia: W.B. Saunders Co. 1994;830-839.

  1. Coleman C.M, Stroje RC. Clin Chim Acta 1966;13:401.

  2. Kaplan A, Szabo LL, Opheim KE. Clinical Chemistry: Interpretation and Techiniques. Philadelphia: Lea & Febiger 1988:190-191.

  3. King EJ. J Path Bact. 1943;55:31.

  4. Lopes HJJ. Enzimas no Laboratório Clínico-Aplicações Diagnósticas. BH, Analisa Diagnóstica, 2000.

  5. Roy AV. Clin Chem 1970;16:431.

  6. FOSFATASE ALCALINA, Instruções de Uso, Gold Analisa Diagnóstica.






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Destino

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