Hemagen® Cardiolipin



Baixar 84.49 Kb.
Encontro09.06.2018
Tamanho84.49 Kb.

HEMAGEN®

Kit de anticorpos Anticardiolipina Hemagen®

(Método EIA)


Para uso em diagnósticos in vitro

Catálogo no.: 66011-01

Descrição: kit para 96 testes

Hemagen Diagnostics, Inc.

9033 Red Branch Road

Columbia, Maryland 21045

U.S.A.
1-800 Hemagen

Telefone: 443-367-5500

Fax: 410-997-7812

http://www.hemagen.com


Publicado em 14 de agosto de 2003

706011.02



USO DO PRODUTO


O kit de anticorpos anticardiolipina Hemagen (catálogo no 66011-01) é um kit enzima imunoensaio (ELISA) desenvolvido para detecção semiquantitativa dos autoanticorpos IgG e IgM contra a cardiolipina presentes na circulação. Para uso em diagnósticos in vitro.

RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE


Os autoanticorpos direcionados contra os fosfolipídios, e a anticardiolipina (aCL) em particular, estão associados a trombose, trombocitopenia e abortos espontâneos recorrentes.1,2,3 A aCL é encontrada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, em pacientes com outras doenças do tecido conjuntivo4, em indivíduos em tratamento com clorpromazina5, bem como em pessoas que não têm doenças crônicas.

PRINCÍPIO DO TESTE


No kit enzima imunoensaio, a cardiolipina é colocada sobre a superfície interna de tiras de micropoços. Amostras de soro de pacientes são colocadas nos poços de teste, onde os anticorpos anticardiolipina, se houver, ligam-se à cardiolipina por meio da glicoproteína β2.

Após um período de incubação, as amostras são lavadas e os poços são enchidos com anticorpo anti-IgG humana ou anti-IgM humana conjugado à peroxidase de raiz-forte. Esse segundo anticorpo liga-se aos poços da etapa anterior que contêm aCL. Por sua vez, a presença do conjugado é determinada pela ação da peroxidase no substrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). A placa é lida a 450 nm, e as concentrações de aCL são calculadas tomando-se como referência soro calibrador incluído no kit.


REAGENTES


Os seguintes componentes fazem parte do Kit de Anticorpos Anticardiolipina Hemagen:

Microplaca com cardiolipina

Microtiras plásticas, destacáveis, de fundo plano, revestidas com cardiolipina derivada de coração bovino. Conservar entre 2ºC e 8ºC, na bolsa original, até a hora de usar. Deixar a embalagem atingir a temperatura ambiente (18°C-25°C) antes de abrir. As placas podem ser guardadas novamente, bem vedadas, na bolsa original contendo dessecante. Usar em até 30 dias depois de abrir a embalagem. Cada kit contém 96 poços.



Conjugado HRP (IgG)

Soro de cabra anti-IgG humana (específico da cadeia ), liofilizado, ligado à peroxidase de raiz-forte. Contém soro animal, azul de Evans e timerosal 0,03% em solução salina tamponada. Conservar entre 2ºC e 8°C. Reconstituir cada frasco (conforme necessário) com 5,5 mL de água destilada. O material reconstituído pode ser armazenado entre 2ºC e 8ºC por até 30 dias. Evitar exposição prolongada à luz. Frasco de 5,5 mL.



Conjugado HRP (IgM)

Soro de cabra anti-IgM humana (específico da cadeia ), liofilizado, ligado à peroxidase de raiz-forte. Contém soro animal, azul de Evans e timerosal 0,03% em solução salina tamponada. Conservar entre 2ºC e 8°C. Reconstituir cada frasco (conforme necessário) com 5,5 mL de água destilada. O material reconstituído pode ser armazenado entre 2ºC e 8ºC por até 30 dias. Evitar exposição prolongada à luz. Frasco de 5,5 mL.



Controle negativo

S


oro humano liofilizado, processado com azida sódica 0,1% como preservativo. Reconstituir com 0,3 mL de água destilada no mínimo 30 minutos antes de usar. Não contém anticorpos anticardiolipina. Desenvolvido para produzir valores normais de aCL quando utilizado de acordo com as instruções. Estável por até 30 dias quanto mantido entre 2ºC e 8ºC. As alíquotas podem ser congeladas a -20ºC e armazenadas por 6 meses.

Calibrador de aCL (IgG)

Soro humano processado, liofilizado, contendo anticorpos anticardiolipina da classe IgG. Consultar o rótulo para obter informações sobre a atividade GPL. Reconstituir com 0,3 mL de água destilada no mínimo 30 minutos antes de usar. Contém azida sódica 0,1%. Estável por até 30 dias quando mantido entre 2ºC e 8ºC. As alíquotas podem ser congeladas a -20ºC e armazenadas por 6 meses.



Calibrador de aCL (IgM)

Soro humano processado, liofilizado, contendo anticorpos anticardiolipina da classe IgM. Consultar o rótulo para obter informações sobre a atividade MPL. Reconstituir com 0,3 mL de água destilada no mínimo 30 minutos antes de usar. Contém azida sódica 0,1%. Estável por até 30 dias quando mantido entre 2ºC e 8ºC. As alíquotas podem ser congeladas a -20ºC e armazenadas por 6 meses.



Controle positivo

Soro humano processado, liofilizado, contendo anticorpos anticardiolipina IgG e IgM. Consultar o rótulo para obter as faixas de valores. Reconstituir com 0,3 mL de água destilada no mínimo 30 minutos antes de usar. Contém azida sódica 0,1%. Estável por até 30 dias quanto mantido entre 2ºC e 8ºC. As alíquotas podem ser congeladas a -20ºC e armazenadas por 6 meses.



TMB

Substrato de peroxidase de raiz-forte, pronto para uso. Contém tetrametilbenzidina. Conservar entre 2ºC e 8°C. Frasco de 11 mL.



Ácido sulfúrico 1N

Ácido sulfúrico 1 N para cessar a reação enzimática. Armazenar à temperatura ambiente ou entre 2ºC e 8ºC. Frasco de 6 mL.



Diluente de soro

Solução salina contendo soro animal, azul de metileno, estabilizantes e azida sódica 0,3%. Para diluição de amostras de pacientes, calibradores e soros de controle. Conservar entre 2ºC e 8°C. Frasco de 50 mL.



Solução de lavagem concentrada

PBS concentrado. Antes de usar, armazenar à temperatura ambiente ou entre 2ºC e 8ºC. Para preparar a solução de lavagem, diluir o conteúdo do frasco com água destilada até completar um litro. Utilizar como tampão de enxague e de lavagem entre as etapas de incubação conforme as instruções. Frasco de 30 mL.



Precauções

  1. Atenção: Contém material biológico potencialmente perigoso. Cada amostra de doador utilizada na preparação dos materiais de controle foi testada por um método aprovado pela FDA para detectar a presença de anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), bem como contra o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), com resultados negativos. Porém, como nenhum método de teste pode oferecer garantia total de que os materiais biológicos não contenham o vírus HIV, vírus da hepatite ou outros agentes infecciosos, todos os reagentes deverão ser manuseados de acordo com o nível 2 de biossegurança, conforme recomendado para qualquer amostra potencialmente infecciosa de sangue ou de soro humano no manual de Biossegurança em Laboratórios Biomédicos e de Microbiologia, 3ª edição, 1993, dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças/Institutos Nacionais de Saúde.

  2. Alguns reagentes contêm azida sódica. A azida sódica pode reagir com tubulações de cobre e de chumbo, formando azidas metálicas explosivas. Ao descartar os reagentes, lavar com água em abundância para evitar o acúmulo de azida nas tubulações.

  3. O ácido sulfúrico causa irritação e pode provocar queimaduras. Evitar o contato com os olhos. Em caso de contato com a pele, lavar imediatamente com água em abundância.

  4. O timerosal é uma substância tóxica usada como agente bacteriostático em vários reagentes. Em caso de contato com a pele ou os olhos, lavar imediatamente com água.

COLETA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS


As amostras de soro devem ser coletadas sob condições assépticas. Aguardar até que todo o sangue coagule; a seguir, centrifugar e remover o material particulado do soro. Decantar imediatamente. As amostras podem ser mantidas entre 2ºC e 8ºC por vários dias ou congeladas a -20ºC para períodos mais longos. Não é recomendável recongelar e descongelar novamente o soro. As amostras de soro não devem ser inativadas pelo calor,6 e o plasma recalcificado não deve ser substituído por soro verdadeiro.

Cuidado: O soro humano pode ser fonte de vírus HIV, vírus da hepatite e outros agentes infecciosos. Por isso, todas as amostras devem ser consideradas transmissoras de doenças e manuseadas como tal.

PROCEDIMENTO DE TESTE


Utensílios necessários não fornecidos com o kit:

  • tubos de ensaio pequenos ou minitubos para as diluições iniciais do soro;

  • micropipetas com ponteiras;

  • pipetas de oito canais e capacidade para 50 L e 100 L por canal;

  • recipientes para reagentes e frasco de apertar ou lavadora de microplacas automática;

  • leitora de placas EIA a 450 nm para leitura dos resultados.

      1. Observações sobre o procedimento

  1. É recomendável realizar duas corridas de controles, calibradores e amostras de soro dos pacientes.

  2. Para melhores resultados, as diluições de soro devem ser preparadas em minitubos de 1 mL. Em seguida, as alíquotas podem ser facilmente transferidas para as tiras de teste com o uso de uma pipeta de oito canais.

  3. A lavagem adequada dos poços de teste pode ser feita com um frasco de apertar cheio de solução de enxágue. Outra opção é utilizar uma lavadora de microplacas automática programada para liberar volumes de 250-350 L por poço quatro vezes seguidas.

  4. Importante: Ao usar uma lavadora de microplacas automática é preciso verificar se ela pode acomodar uma tira parcial de micropoços antes de separar os poços uns dos outros.

  5. Importante: Para adicionar reagentes aos poços é necessário levar as ponteiras das pipetas até o fundo do poço de teste. Em particular, não se deve deixar material residual de uma etapa na borda de um poço, pois ele pode interferir com a reação de uma etapa posterior.

    1. Controle de qualidade

  1. Cada corrida deve consistir em um branco (diluente de soro), o controle positivo, o controle negativo e calibradores de aCL apropriados.

  2. Os calibradores e os controles não são pré-diluídos e devem ser processados da mesma maneira que as amostras de pacientes.

  3. Se os valores do controle positivo estiverem fora das faixas especificadas no rótulo do frasco, o ensaio deverá ser repetido.

  4. Além do teste dos soros de controle fornecidos pela Hemagen, recomenda-se que cada laboratório estabeleça seus próprios padrões sorológicos internos e os inclua em seu protocolo de teste rotineiramente.

    1. Protocolo de teste

  1. Reconstituir os conjugados HRP liofilizados, o controle positivo, o controle negativo e os calibradores de aCL com água destilada no volume especificado no rótulo ou aguardar até que os reagentes previamente reidratados atinjam a temperatura ambiente (18ºC-25ºC).

  2. Diluir a solução de lavagem concentrada com água destilada até completar um litro. Transferir para o frasco plástico ou para uma lavadora de microplacas automática.

  3. Preparar as diluições de soro. Diluir cada amostra de paciente e o controle positivo, o controle negativo e os calibradores de aCL na proporção de 1:51 adicionando 10 L de soro a 500 L de diluente de soro em um tubo de ensaio ou minitubo etiquetado.

  4. Fixar firmemente as microtiras no suporte e identificar cada tira de 2x8 a ser utilizada com "IgG" ou "IgM". Transferir 100 L de cada amostra e cada controle (em duplicata, se desejado) para os poços de uma microtira marcada com "IgG” usando uma pipeta de oito canais. Do mesmo modo, transferir alíquotas de 100 L para os poços correspondentes de uma microtira marcada com "IgM". Não esquecer de incluir os poços de branco (diluente de soro). Bater levemente na placa para assegurar a distribuição uniforme da amostra.

  5. Incubar a placa por 30 minutos à temperatura ambiente (18ºC-25 °C).

  6. Descartar as amostras sacudindo a placa, tendo o cuidado de manter distância dela, para expelir o conteúdo em um recipiente adequado para descarte ou inserir a placa em uma lavadora automática.

  7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de enxágue. Encher cada poço com um leve jato e, em seguida, descartar a solução. Se uma lavadora de microplacas manual estiver sendo usada, inverter a placa e batê-la levemente contra um material absorvente após a última lavagem.

  8. Com uma pipeta de oito canais, transferir 100 L do conjugado HRP (IgG) para cada poço marcado com “IgG”. Do mesmo modo, transferir 100 L do conjugado HRP (IgM) para cada poço marcado com “IgM”. Bater levemente na placa como na etapa 4.

  9. Incubar a placa por 30 minutos à temperatura ambiente (18ºC-25 °C).

  10. Descartar os conjugados HRP sacudindo a placa, tendo o cuidado de manter distância dela, para expelir o conteúdo em um recipiente adequado para descarte ou inserir a placa em uma lavadora automática.

  11. Lavar a placa 4 vezes com a solução de enxágue, como na etapa 7.

  12. Transferir 100 L de TMB para cada poço. Bater levemente na placa, como antes.

  13. Incubar a placa por 10 minutos à temperatura ambiente (18ºC-25°C).

  14. Transferir 50 L de ácido sulfúrico 1 N para cada poço para cessar a reação enzimática.

  15. Bater levemente na placa para dispersar os reagentes e ler a placa imediatamente em uma leitora de placas EIA ajustada para 450 nm. Antes de ler as amostras, zerar a leitora em um poço que recebeu diluente de soro na primeira etapa.

Interpretação dos resultados


Os resultados são obtidos por exame da placa em uma leitora EIA a 450 nm. A intensidade da cor amarela final está relacionada com a quantidade de aCL presente na amostra. A leitura da densidade óptica (D.O) do branco deve ser subtraída da leitura de cada amostra e de cada controle. Calcular a concentração de anticardiolipina conforme descrito abaixo:

  1. Os calibradores de aCL (IgG e IgM) contêm anticorpos anticardiolipina das classes IgG e IgM, respectivamente. Consultar o rótulo do frasco para obter os valores de aCL em unidades GPL e MPL. (Segundo a nomenclatura de Harris et al.,7 1 unidade GPL = a atividade de ligação de 1 g/mL de aCL IgG; 1 unidade MPL = a atividade de ligação de 1 g/mL de aCL IgM.) Esses valores foram derivados de soros de referência secundários com base em preparações da Louisville APL Diagnostics, Inc.

  2. Subtrair a leitura da D.O do branco da leitura da D.O dos outros poços. Calcular a média para cada conjunto de leituras duplicadas.

  3. Dividir os valores GPL e MPL dos calibradores de aCL pelas DOs médias correspondentes.

  4. Multiplicar cada D.O média pelo fator apropriado (IgG ou IgM), conforme calculado na etapa 3, para determinar os valores GPL e MPL dos controles e amostras de teste desconhecidas.

  5. As amostras que derem valores superiores a 80 unidades GPL ou 80 unidades MPL deverão ser diluídas e testadas novamente. Multiplicar os novos resultados pelo fator de diluição.

  6. As amostras de pacientes podem ser classificadas como normais, levemente positivas, moderadas ou altamente positivas de acordo com as recomendações publicadas pela Louisville APL Diagnostics:






GPL

MPL

Normal

< 10

< 10

Levemente positiva

< 20

< 20

Moderada

< 80

< 80

Altamente positiva

 80

 80


LIMITAÇÕES DO TESTE


  1. Os testes aqui descritos exigem uma diluição inicial do soro de 1:51. Os resultados obtidos com diluições menores (p. ex., 1:10, 1:20) não têm significado clínico.

  2. Embora a aCL tenha sido associada a certos subtipos de LES1-3, o significado clínico da aCL no LES e em outras doenças continua sendo pesquisado.

  3. A faixa de concentrações “normais” de aCL pode variar de população para população. As faixas normais mostradas acima são as recomendadas pelo laboratório Louisville APL Diagnostics8, confirmadas por estudos de doadores de sangue aleatórios na área de Boston. Os laboratórios de teste, no entanto, são incentivados a definir as faixas de normalidade para sua região.

  4. O significado clínico de cada resultado de teste depende de sua relação com outros dados médicos do paciente. O diagnóstico e o tratamento de doenças devem basear-se na avaliação de todas as informações relativas ao paciente.

  5. Nossa equipe técnica está sempre à disposição para ajudar caso o usuário encontre dificuldades em utilizar o kit Hemagen. Basta nos contatar pelo telefone (800) 436-2436; a ligação é gratuita.

VALORES ESPERADOS


Níveis elevados de anticorpos anticardiolipina são eventualmente observados na população normal, embora isso não seja comum. No entanto, vários processos autoimunes e infecciosos podem causar aumento passageiro ou crônico de aCL. Níveis elevados de aCL foram relatados em pacientes com LES, artrite reumatóide, tuberculose, síndrome de Behcet e outras doenças9-12.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO


  1. Precisão

Quatro amostras foram testadas 15 vezes em duplicata em uma única corrida a fim de estabelecer a precisão durante a corrida. Os resultados são mostrados abaixo:




IgG

IgM

Amostra

Grau

GPL médio

CV %

Grau

MPL médio

CV %

1

Baixo +

18

7

Moderado +

54

7

2

Moderado +

25

9

Moderado +

25

16

3

Baixo +

19

9

Alto +

95

11

4

Baixo +

1

0


10

Moderado +

49

13

Em um experimento separado, quatro amostras foram testadas 15 vezes, em duplicata, no curso de três dias. Os resultados estão resumidos abaixo:






IgG

IgM

Amostra

Grau

GPL médio

CV %

Grau

MPL médio

CV %

5

Baixo +

20

2

Moderado +

50

5

6

Baixo +

17

7

Alto +

82

1

7

Normal

8

13

Moderado +

38

1

8

Moderado +

22

4

Baixo +

19

3

  1. Acurácia

Cinquenta amostras de soro de doenças autoimunes foram testadas para verificar a presença de anticorpos anticardiolipina das classes IgG e IgM usando o kit Hemagen e outro kit EIA comercialmente disponível. As amostras de pacientes compreendiam: 10 amostras de esclerodermia, 10 amostras de síndrome de Sjogren, 10 amostras de lúpus eritematoso sistêmico de pacientes com história de trombose, 10 amostras de LES de pacientes sem história de trombose e 10 amostras adicionais de pacientes com LES. Os resultados estão resumidos abaixo:

IgG

Método de comparação

POSITIVO

NEGATIVO

Hemagen Diagnostics

POSITIVO

21

1

NEGATIVO

0

28



IgM

Método de comparação

POSITIVO

NEGATIVO

Hemagen Diagnostics

POSITIVO

21

0

NEGATIVO

1

28



  1. Amostras normais

Cinquenta e um doadores de sangue aleatórios foram testados para verificar a presença de anticorpos anticardiolipina usando o kit Hemagen e o mesmo método de comparação EIA. Todas as cinquenta e uma amostras produziram valores GPL dentro da faixa normal (< 10 GPL, média = 1,5 GPL). No teste de IgM, quarenta e nove amostras produziram valores MPL dentro da faixa normal (<10 MPL, média = 0,9 MPL) e dois doadores de sangue (4%) foram positivos para ambos os métodos de teste.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


  1. Harris EN, Gharavi AE, Boey ML, Patel BM, Mackworth-Young CG, Loizou S, Hughes GRV, 1983, "Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus," Lancet ii: 1211-1214.

  2. Hamsten A, Norberg R, Bjorkholm M, De Faire U, Holm G, 1986, "Antibodies to cardiolipin in young survivors of myocardial infarction: an association with recurrent cardiovascular events," Lancet i: 113-116.

  3. Harris EN, Asherson RA, Gharavi AE, Morgan SH, Berue G, Hughes GRV, 1985, "Thrombocytopenia in SLE and related autoimmune disorders: association with anticardiolipin antibody," Br J Haematol 59: 231-234.

  4. de Brum-Fernandes AJ, Cossermelli-Messina W, Bueno C, Santiago MB, Weidebach W, Cossermelli W, de Oliveira RM, 1989, "Anticardiolipin antibodies in patients with rheumatoid arthritis," Clinical Rheumatology 8: 484-488.

  5. associated autoantibodies: a prevalence study," BioI Psychiatry 27: 863-870.

  6. Santiago MB, Bueno C, Viana V, Cossermelli W, Oliveira RM, 1989, "Influence of serum inactivation on detection of anticardiolipin antibodies by ELISA," Clin Exp Rheumatol (Letters) 7: 99-100.

  7. Harris EN, Gharavi AE, Patel SP, Hughes GRV, 1987, "Evaluation of the anti-cardiolipin antibody test: report of an international workshop held 4 April 1986," Clin Exp Immuno 68: 215-222.

  8. Harris EN, Instructions for Use of the IgG/lgM Calibrators, Louisville APL Diagnostics, Inc., Louisville, KY USA.

  9. Canoso RT, de Oliveira RM, 1988, "Chlorpromazine-induced anticardiolipin antibodies and lupus anticoagulant: absence of thrombosis," Am J Hematol 27: 272-275.

  10. Santiago MB, Cossermelli W, Tuma MF, Pinto MN, Oliveira RM, 1989, "Anticardiolipin antibodies in patients with infectious diseases," Clin Rheumatol 8: 23-28.

  11. Pereira R-M R, Goncalves CR, Bueno C, de Souza Meirelles E, Cossermelli W, de Oliveira RM, 1989, "Anticardiolipin antibodies in Behcet's syndrome: a predictor of a more severe disease," Clin Rheumatol 8: 289-291.

  12. Santiago MB, Stellin R, Gaburo N Jr, Bueno C, Viana VST, Cossermelli W, de Oliveira RM 1990, "Antiphospholipid antibodies in syphilis," Brazilian J Med Res 23: 397-402.

  13. Sabbaga J, Neto JF, Chaddad R, Cecconello I, de Oliveira RM, 1991, "A 'primary' thrombotic syndrome: absence of antiphospholipid antibodies," Clin Rheumatol 10: 81-83.


TERMO DE GARANTIA
Este kit como um todo tem garantia de troca, desde que esteja dentro do prazo de validade e seja comprovado pela Assessoria Científica da HEMAGEN DIAGNÓSTICOS de que não houve falhas técnicas na execução, manuseio do teste e na conservação do produto.
Importado e Distribuído por:

HEMAGEN DIAGNÓSTICOS COM. IMP. EXP. LTDA.

Rua Doutor Diogo de Faria, 109 – Vila Clementino

São Paulo - SP - CEP 04037-000

Fone: (011) 3819-5222. Fax: (011) 3816-7623

CGC: 64.002.686/0001-32

Resp. Técnico: Dhália Gutemberg CRF 07.183 - SP


Fabricado por:

HEMAGEN DIAGNOSTICS INC.

9033 Red Branch Road

Columbia, MD 21045 - USA

Fone: (800) 436-2436 ou 617-890-3748



SERVIÇO DE ATENDIMENTO AO CLIENTE


Quaisquer dúvidas técnicas, no manuseio deste kit ou no seu procedimento entrar em contato com a ASSESSORIA CIENTÍFICA DA HEMAGEN DIAGNÓSTICOS, que estará sempre à disposição para auxiliar quando ocorrerem dificuldades na utilização de seus produtos. Contate a HEMAGEN através do seguinte endereço:


HEMAGEN DIAGNÓSTICOS COM. IMP. EXP. LTDA.

Rua Doutor Diogo de Faria, 109 – Vila Clementino

São Paulo - SP - CEP 04037-000

Fone: (011) 3819-5222. Fax: (011) 3816-7623


DATA DA REVISÃO DAS INSTRUÇÕES DE USO
Documento Revisado em: - Março de 2014






Compartilhe com seus amigos:


©ensaio.org 2017
enviar mensagem

    Página principal