Inclusão de células mesenquimais em scaffold de fosfato de cálcio para testes in vivo e in vitro



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Inclusão de células mesenquimais em scaffold de fosfato de cálcio para testes in vivo e in vitro
Rodrigues, L.R.1,2,3,4,5; Almeida, A.B.A6; Feliciano, D.F.1,2,6; Raposo-Amaral, C.E.6; Passos-Bueno, M.R.7; Bueno, D.F.7; Alamada, B.V.P.6; Fernandes, M.H.5; Monteiro, F.J.M. 3,4 and Zavaglia, C.A.C. 1,2
1 Departmento de Engenharia de Materiais, Faculdade de Engenharia Mecânica, UNICAMP, Campinas, (SP), Brasil;

2 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação, Campinas, (SP), Brasil;

3 Departamento de Engenharia Metalúrgica e Materiais, Faculdade de Engenharia, Universidade do Porto, Porto, Portugal;

4 INEB- Instituto de Engenharia Biomédica, Porto, Portugal;

5 Laboratório de Farmacologia e Biocompatibilidade Celular, Faculdade de Medicina Dentária (FDMUP), Universidade do Porto, Porto, Portugal;

6 SOBRAPAR - Instituto de Cirurgia Plástica Crânio Facial, Campinas, (SP), Brasil.

7 Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, USP, (SP), Brasil.

E-mail: leo5002@fem.unicamp.br




Resumo. A nanotecnologia e a engenharia tecidual em conjunto estão trazendo muitas esperanças no tratamento de doenças antes incuráveis, por serem áreas multidisciplinares estão abrangendo vários estudos na área da medicina regenerativa com o objetivo de tratar um grande número de doenças, além de serem criadas novas táticas para recuperação de um tecido perdido por acidente. Foram escolhidos para este trabalho nanopartículas de fosfato de cálcio. Os fosfatos de cálcio foram escolhidos por sua semelhança com a fase mineral do tecido ósseo e se optou em utilizar nanopartículas por se conhecida a melhora das propriedades dos materiais resultantes de compósitos que utilizam materiais nanopartículados. A hidroxiapatita induz o crescimento ósseo e o alfa-TCP em contato com o fluido corpóreo forma um cimento dando mais resistência mecânica ao scaffold. O scaffold foi produzido em forma de pastilha porosa. As pastilhas porosas foram semeadas com células tronco mensenquimais e implantadas em ratos para verificar o comportamento das células presentes no scaffold quando em contato com o tecido ósseo. As partículas foram caracterizadas utilizando difração de raios X (DRX), equação de Scherrer, florescência de raios X (FRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV). As pastilhas porosas foram caracterizadas utilizando DRX, FRX, MEV, picnometria, e Micro-CT. Foram feitas análises dos testes in vitro com células MG63 e análises histológicas das laminas com os tecidos formados no ensaio in vivo utilizando os scaffolds e células tronco mesenquimais.
Palavras-chave: Hidroxiapatita, Fosfato tricálcio, Engenharia tecidual, Células tronco mesenquimais, Teste in vivo.

1. INTRODUÇÃO
A engenharia tecidual é um campo de estudo considerado multidisciplinar que engloba principalmente as áreas médicas, biológicas e engenharias. Cada área representa uma parte importante, como é descrito a seguir: i) engenharia produz os scaffolds que são utilizados como guia e suporte para as células, ii) biologia é responsável pela aquisição, crescimento, proliferação, diferenciação e pelo ato de semear as células tronco nos scaffolds, iii) medicina é responsável por realizar os testes in vitro, in vivo e testes clínicos.

Para a engenharia tecidual óssea é necessário utilizar moldes confeccionados a partir de biomateriais com as dimensões do defeito ósseo presente na região injuriada do paciente, além ser necessário semear os scaffolds com uma grande quantidade de células para poder aumentar a probabilidade das células aderirem em toda a superfície do scaffold, e assim acabar por regenerar o tecido defeituoso [BUENO, D. F., 2007].

Os moldes utilizados recebem o nome de scaffolds, que são objetos tridimensionais com poros interconectados, esses poros devem ser controlados em tamanho e forma, devido a sua aplicação que é de suporte e guia para o crescimento celular e quando semeados com células tronco mesenquimais possuem condição de formar tecidos naturais.

A escolha por biocerâmicas foi devido aos grandes avanços nesta área gerados durante os últimos anos, mas como constatado durante a revisão bibliográfica ainda existem muitos assuntos a serem explorados tendo como finalidade estudos direcionados a engenharia tecidual óssea.

Os fosfatos de cálcio são biocerâmicas conhecidas como substitutos ósseos sintéticos, porém muito semelhantes com a fase mineral do tecido ósseo, por este motivo a hidroxiapatita e o fosfato tricálcio foram escolhidos para serem utilizados nesta pesquisa.

A hidroxiapatita (HA) sintética Ca10(PO4)6(OH)2 com massa molecular de 1004,657g/mol é um material cerâmico bioativo e que não é absorvido pelo organismo, já o fosfato tricálcio (TCP – [Ca3(PO4)2],) é considerado reabsorvível, por este motivo se pensou em utilizar os dois na formação de um compósito.

A hidroxiapatita induz o crescimento do tecido ósseo ao mesmo tempo em que mantem uma estrutura com poros interconectados para guiar e dar suporte as células, já o fosfato tricálcio é reabsorvido e transformado em tecido ósseo.

Beta-fosfato tricálcio [β-Ca3(PO4)2] (β-TCP), é considerado um biomaterial reabsorvível, esta propriedade garante o equilíbrio entre absorção do material e a formação do novo tecido ósseo [SAGAWA, H.; et. al.; 2010].

O alfa-fosfato tricálcio [α-Ca3(PO4)2], (α-TCP), é utilizado para promover a nova formação óssea e promover a calcificação de forma mais rápida. A fase alfa-TCP é gerada a partir de um tratamento térmico na fase beta-TCP, a mudança de fase se inicia quando o material atinge a temperatura de 1050°C.

Um dos objetivos que se deseja atingir na regeneração ortopédica é a rápida remineralização dos defeitos ósseos e, para atingir este objetivo, tem se estudado a aplicação de células tronco mesenquimais com a intenção de diferenciá-las em osteoblastos. O estudo de várias condições que levam à máxima mineralização no menor tempo possível tem sido o alvo de algumas pesquisas [THIMM, B.W.; et. al.; 2011]. Esta técnica vem como alternativa a enxertos e aloenxertos na área de tratamento ortopédico.

A engenharia de tecidual necessita de um suporte para crescimento celular, denominada arcabouço 3D ou em inglês “scaffold. Os scaffolds podem ser produzidos em materiais: metálicos, poliméricos, cerâmicos ou compósitos [SALERNO, A.; et. al.; 2010].

Atualmente a engenharia tecidual está associada ao reparo ou substituição de partes ou tecidos inteiros como, osso, cartilagem, vasos sanguíneos, bexiga, pele, entre outros [PENOLAZZI, L.; et. al.; 2011].

Em 1959 o físico Richard Feynman proferiu uma conferência no encontro anual da Sociedade Americana de Física sobre o controle e manipulação da matéria na escala atômica. Feynman defendeu que não existia nenhum obstáculo teórico para a construção de pequenos dispositivos construídos átomos a átomos, nem mesmo o princípio de incerteza de Heisenberg [TOUMEY, C., 2005]. As nanopartículas por definição devem ter entre 1nm e 100 nm [QUINA, F.H., 2004]. A palavra "nanotecnologia" foi utilizada pela primeira vez pelo professor Norio Taniguchi em 1974 para descrever as tecnologias que permitem a construção de materiais com escala de 1 nanômetro [FAHLMAN, B.D., 2007].

Existem vários métodos de obtenção de nanopartículas, por exemplo: i) Método Pechini [PECHINI, M.P., 1967]; ii) Microemulsão [SMALL, D.M., 1977] [ATTWOOD, D., et al., 1983] [SHARMA, M.K., et al., 1985]; iii) Co-precipitação [BUENO, J.M.C., 1987] [PINHEIRO, E.A., 1992] [KAMBLE, R.B.; et al.; 2008]; iv) Processo sol-gel; processo sol-gel com sacarose [SOUZA, E.A.; et. al.; 2007] [RODRIGUES, L.R.; et. al.; 2011].

Os scaffolds são estruturas tridimensionais com poros interconectados e com o tamanho dos poros por volta de 100 a 400 μm [BEN-NISSAN, B., et. al., 2004] que favorecem a condução celular contribuindo significativamente para o desenvolvimento do novo tecido ósseo.

Estudos utilizando células tronco obtidas a partir de DPSC (DPSC - dental pulp stem cell ou célula mesenquimal da polpa dentária) é considerada uma rota eficiente de obtenção de células tronco mesenquimais [BUENO, D.F.; et, al.; 2011]. As células são cultivadas e com os suplementos adequados elas se diferenciam em osteoblatos, que são as células formadoras dos tecidos ósseo [BUENO, D. F., 2007].

O objetivo deste trabalho foi obter estruturas porosas (scaffolds) a partir do compósito HA/TCP para serem aplicados como novos materiais na engenharia tecidual óssea. Para a confecção dos scaffolds foram utilizadas nanopartículas comerciais da marca Fluidinova,SA. Para os testes in vivo foram utilizadas células tronco mesenquimais.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados:
i) Prensa simples; ii) Molde de base circular; iii) Sacarose (açúcar) - agente porogênico; iv) Hidroxiapatita fluidinova nanoXIM-HAp202 artigo 50120208; v) TCP (fosfato tricálcio) fluidinova nanoXIM-TCP202 artigo 50220208; vi) HA + TCP 50% em massa de cada um + sacarose (exemplo: 2g de HA + 2g de TCP + 4g de sacarose); vii) Sinterização a 1330°C (temperatura ambiente até 500ºC para eliminar a sacarose, depois de 500ºC até 1330ºC).

A Figura 1 mostra o fluxograma da obtenção do compósito em forma de pastilha cerâmica porosa denominada “Amostra”.




Figura 1 - Fluxograma de produção dos scaffolds em forma de pastilha porosa.

A difração de raios-X é utilizada para identificar as fases cristalinas através de picos gerados pelo equipamento e os resultados dos materiais sintetizados são comparados com os resultados dos materiais comerciais, além de ser possível consultar a biblioteca JCPDS e comparar os resultados obtidos com os picos já padronizados [RODRIGUES, L.R., 2008]. Foi utilizados o equipamento Philips X´Pert do laboratório central de análises pertencente à Universidade de Aveiro e o equipamento DMAX 2200-Rigaku Co – radiação Cu-Kα (λ= 1,5406), com filtro de Ni do departamento de Engenharia de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica pertencente a Universidade Estadual de Campinas foram realizadas as análises dos materiais cristalinos. O equipamento foi ajustado em 40kv e 30mA.

Nas amostras hidroxiapatita, fosfato tricálcio e scaffolds a difração de raios X foram realizadas com um passo de 0,02° a cada 2 segundos, em 2 Theta/Theta, estes parâmetros foram aplicados em um intervalo de 20° até 50°, pois é onde se localizam os principais picos da HA, beta-TCP e alfa- TCP.

Foi aplicada a equação de Scherrer associada à difração de raios X para verificar o tamanho aproximado dos cristalitos das amostras [NAG, M., et. al., 2007]. A seguir é apresentada a Eq.(1) que define o tamanho médio do cristalito:


t= 0,9λ / βcos θ Equação (1)
Onde “t” representa o tamanho médio do cristalito. “λ” é o comprimento de onda da radiação eletromagnética. A variável “β” é a largura do pico a meia altura do pico principal de difração e “θ” é o ângulo de Bragg (ângulo de difração). Os parâmetros de “β” foram corrigidos por meio da equação apresentada a seguir Eq.(2):
β = β2exp – β2int Equação (2)

Em que “β exp” é a largura a meia altura medida e “β inst” é a largura a meia altura padrão. O “padrão” geralmente é um monocristal e com o tamanho de cristalito conhecido. Para este cálculo é considerado que o pico da difração de raios X apresenta uma distribuição gaussiana.

Para a análise de fluorescência de raios X (FRX) foi utilizado o equipamento Rigaku RIX 3100 varredura completa para análise de possíveis impurezas presentes no material. Para análise é necessário criar um disco compactado do material de 30mm de diâmetro utilizando uma cargas de 10MPa aplicada por 60 segundos.

A microtomografia foi utilizada para verificar a interconectividade dos poros, se possuem distribuição homogênea, se estão em torno de 100 a 400 micrômetro de diâmetro e qual é a porcentagem total de porosidade em relação à estrutura. Com as imagens geradas pelo (Micro-CT) microtomógrafo de raios X SKYSCAN 1074 foi possível criar modelos 3D que puderam ser cortados virtualmente e assim visualizar a porosidade interna do material. O software de captação de imagem foi o control skycan 1074. O software de análise de dados para geração dos gráficos foi o CTAn. O software utilizado para criar o modelo 3D foi o ANT.

As pastilhas porosas utilizaram 1500ms de exposição à radiação com 40kV, 1000mA e com um passo de 0,9° a cada avanço. A reconstrução escolhida foi de 360°.

O equipamento picnometro ultrapyc 1200e Quantachrome foi utilizado na determinação da densidade dos scaffolds, onde o gás penetra em duas câmaras uma com o material e a outra vazia para controle e comparação. Para os testes foram utilizados: i) gás hélio seco, ii) foram realizadas 3 medições consecutivas com a pressão da câmara constante em 18psig, iii) volume da célula de 58,518cc, iv) foi utilizada a câmara grande com o volume de 80,829cc e v) tempo de preenchimento da câmara com o gás foi de 1 min.

ESEM (microscopia eletrônica de varredura ambiental) tem como foco principal de utilização a análise de superfície de amostras não-metálicas. A amostra é colocada numa câmara interna com pressão mais elevada, ao invés de vácuo como ocorre no SEM. Este tipo de microscópio electrônico neutraliza a carga negativa sobre a superfície da amostra quando o feixe interage com o gás. O tipo de gás pode ser variado de acordo com a necessidade. Neste tipo de microscópio o revestimento é desnecessário. O equipamento utilizado foi FEI Quanta modelo 400 FEG ESEM pertencente ao CEMUP-PT.

O equipamento microscópio confocal de fluorescência por varredura laser pertence ao Instituto de Biologia Molecular e Celular – (IBMC - Portugal), o seu funcionamento consiste em aumentar o contraste da imagem microscópica e construir imagens tridimensionais através da utilização de um orifício de abertura que permite uma grande definição de imagens mais espessas que o plano focal.

O principio da microscopia confocal consiste na utilização de compostos químicos chamados fluoróforos para produzir a fluorescência do material estudado. O uso do fluoróforos em biologia acontece quando se quer localizar uma área específica da amostra ou responder a um estímulo específico. Um típico exemplo de área específica na célula é a proteína. Neste trabalho será colorido o núcleo e os filamentos de fixação das células.

As células foram fixadas com formaldeído a 4% (livre de metanol) permeabilizadas com 0,1% de triton e incubadas em 10 mg mL-1 de albumina sérica bovina (BSA) com 100µL mL-1 de RNAse. Filamentos de actina F foram corados com faloidina conjugada com Alexa Flour e os núcleos foram marcados com 10µg mL-1 de iodeto de propídio. As amostras foram lavadas com PBS e cobertas com Vectashield®. O equipamento utilizado foi o da Marca Leica modelo TCS SP2 AOBS [LARANJEIRA, M.S.; et. al.; 2010].

O Ensaio de coloração MTT (Metil Tiazol Tetrazólio) foi utilizado para verificar a viabilidade celular, que consiste na coloração da mitocôndria ativa de células vivas. A coloração normalmente é em tons de azul escuro. Este teste foi utilizado como teste preliminar nas células cultivadas até o segundo dia, devido a sua simplicidade de processo e o custo mais baixo quando comparado a coloração para a microscopia confocal.

A atividade de desidrogenase mitocondrial de células MG63 viáveis foi determinada utilizando o substrato 3- (4,5 – dimetiltiazol 2-yl) – 2,5-difenil brometo de tetrazolina) da marca Sigma). Os sais de tetrazólio são reduzidos a formazano e que se acumula no citoplasma das células viáveis. Para este propósito foi utilizado 10µL da solução de MTT (5mg mL-1) e foi adicionado a placa de cultura 100µL de meio e incubado a 37ºC em atmosfera húmida com 95% de ar e 5% de CO2 por 3h. Os sais de formazan foram dissolvidos com 200µL de dimetilsulfóxido e as células foram visualizadas em estereoscópio [LARANJEIRA, M.S.; et. al.; 2010].




    1. Ensaio in vitro e in vitro


Cultura de células MG63 para testes in vitro
Para a cultura celular foi utilizado células MG63 e foram cultivadas em meio mínimo essencial Eagle modificado alfa (α - MEM) contendo 10% de soro fetal bovino, 100µg mL-1 de penicilina, 10 IU mL-1 de estreptomicina, 2,5 µg mL-1 de fungizona e 50 µg mL-1 de ácido ascórbico. A incubação das células foi realizada em atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de gás carbonico CO2 a 37ºC. Após a subcultura, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS – Gibco, UK). As células foram retiradas da placa de cultura após a aplicação da solução de tripsina a 37ºC durante 5 minutos e contadas utilizando o equipamento chamado hemocitómetro. As amostras e o grupo controle (placa de cultura) foram semeados com a concentração de 105 células por cm-2. As amostras e o grupo controle foram pré-incubados no meio a 37ºC por 1h em atmosfera humdificada com 95% ar e 5% gás carbonico (CO2). O meio de cultura foi trocado duas vezes por semana. O material após o cultivo foi observado por microscopia confocal de varredura laser (CLSM), lupa fluorescente e estereoscópio, após o 2º dia e o 7º dia de cultura [LARANJEIRA, M.S.; et. al,. de 2010].

Cultura de células mesenquimais para testes in vivo

Para obter células-tronco da polpa dentária de dentes decíduos foi obtida a aprovação do Instituto de Biociências de Ética em Pesquisa (Protocolo 037/2005). Os dentes de NSCL/P (Nonsyndromic cleft lip and palate – fissura de lábio e palato não sindrômica) de pacientes foram retirados pelo Dr. Bueno D. F. - SOBRAPAR, Campinas, São Paulo.

Culturas de células-tronco obtidas a partir de DPSC (DPSC - dental pulp stem cell ou célula mesenquimal da polpa dentária) de dentes decíduos foram estabelecidos de acordo com protocolos já publicados [BUENO, D.F.; et, al.; 2011]. As células foram cultivadas a 37°C com CO2 a 5% em DMEM-F12 (Invitrogen, UK) suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS, HyClone, EUA) e congelados em FBS 40% para o armazenamento. As células congeladas foram descongeladas e cultivadas até 80% de confluência em um balão de 75 cm2 e submetidos a privação de soro (12 h) antes da extração de RNA. Todos os experimentos foram realizados com células entre a subcultura 4 e 8.

As células tronco mesenquimais nos testes in vitro foram diferenciadas em osso, cartilagem, músculo e gordura e estes ensaios foram demonstrados anteriormente (2 dos pacientes NSCL/P e 3 do grupo controle) em trabalhos publicados anteriormente [COSTA, A.M.; et. al.; 2008] [BUENO, D.F., 2007].



Animais

Cinco ratos Wistar foram obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB) e foram mantidos em gaiolas individuais, com comida e água ad libitum com temperatura controlada. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no uso de Animais (CEUA/UNICAMP – Protocolo: 2482-1).



Procedimento Cirúrgico

Os animais foram anestesiados com injeção intramuscular (im) de ketamina (85 mg/kg; im) e xilazina (12 mg/kg; im). O pêlo foi raspado e foi realizada uma incisão mediana (20 mm) na pele ao longo da sutura sagital. A musculatura e o perióstio foram rebatidos expondo o osso parietal.

Dois defeitos osseos de 5,0 mm foram criados com uma trefina na calvária dos ratos. Os implantes HA foram inseridos no defeito ósseo. No defeito ósseo esquerdo foi colocado implante cultivado com as células tronco mesenquimais, e no grupo controle pareado, foi inserido apenas o scaffold sem células. Após a cirurgia a musculatura e o periósteo foram reposicionados. No pós-operatório foi utilizado analsésico Dipirona via oral (500 mg/ml; vo), para o período subseqüente de 24 horas. Todos os animais foram monitorados de perto e alimentados ad libitum.

Procedimento histológico

Os animais foram anestesiados e sacrificados após 8 semanas (56 dias) de implantação por deslocamento cervical. Os discos de implantes foram colhidos e fixados em formalina a 10% descalcificados, desidratados e embebidos em parafina. Foram obtidos cortes histológicos de 5 micrometros de espessura e corados com Hematoxilina & Eosina. A biocompatibilidade do implante HA/TCP foi quantificada pela gravidade da cápsula de fibrose, reação de corpo estranho e processo inflamatório inespecífico. As propriedades de osteocundução foram determinadas pela capacidade de regeneração óssea.


Detalhamento de alguns tópicos:
Comida e água ad libitum: significa que eles tiveram comida e agua a vontade. Como ad libitum é latim, tem de ser escrito em italico.

Injeção intramuscular de ketamina (85 mg/kg; im): efeito de Anestesia/sedação e Analgesia. O “im” quer dizer que foi introduzido via intramuscular. E “vo” quer dizer via oral.

Xilazina (12 mg/kg; im): efeito de sedação, relaxamento muscular e analgesia. A Xilazina foi utilizada associada a anestésicos (Ketamina) para a obtenção de anestesia cirúrgica.

Formalina a 10%: usado para fixar o material e evitar a autólise, preservando assim o tecido.

Descalcifcados: como é osso, temos que descalcificar para deixar o tecido menos duro, caso contrário, quando for fazer os cortes histologicos, a probabilidade de danificar o corte da lamina é grande e assim acabar por realizar cortes mau feitos.

Desidratados: é uma seqüência lavagens com etanol começando com 50% até atingir a concentração de 100% de etanol, passando depois para o xilol. Isto é feito porque é necessário introduzir o material na parafina para fazer os cortes, e a parafina nao se mistura com a água, por isso este processo é necessário, pois retira toda a água do material antes de ser incluído em parafina.

Embebidos em parafina: material é colocado em parafina para a realização do corte histológico.

Hematoxilina e Eosina: é a coloração mais clássica que tem. O material em lamina de parafina é corado com hematoxilina e depois passado na eosina para diferenciar as estruturas do tecido. Hematoxilina é um sal neutro e é considerado um corante básico e tem o potencial de corar o núcleo de modo basófilo com a cor azul a roxo e é utilizado para colorir os componentes ácidos dos tecidos. A eosina (basófila) é um corante ácido e cora os elementos básicos da proteína do citoplasma de maneira acidófila. A eosina é um corante sintético e produz uma coloração vermelha.

Neste processo de coloração os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, dando ao núcleo um tom azul-púrpura, já a eosina é atraída pelos elementos básicos da proteína do citoplasma das células, corando-o de cor vermelha a róseo.


3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na Fig.2 são apresentadas as partículas das amostras de hidroxiapatita e fosfato tricálcio utilizadas para a formação dos scaffolds.

Na Fig.2(a) são mostradas as nanopartículas de HA e é possível ver também que elas estão muito aglomeradas. No detalhe é possível verificar que as partículas têm o tamanho inferior a 100nm e tem a forma esférica.

Na Fig.2(b) são mostradas as nanopartículas de fosfato tricálcio e no detalhe é possível verificar a morfologia de agulhas que é uma característica do fosfato tricálcio. No detalhe é possível verificar que a morfologia em geral é de nanoagulhas.


(a) (b)

Figura 2 - (a): Hidroxiapatita nanoparticulada em forma esférica (Fluidnova, SA). (b) Beta-fosfato tricálcio em forma de nanoagulhas (Fluidnova,SA).
Figura 3 apresenta os difratogramas das amostras de beta-TCP 725 PT e alfa-TCP 1330 PT. O intuito é verificar a mudança da fase beta para a fase alfa do fosfato tricálcio. Como era esperado o beta-TCP calcinado a 1330°C modificou a sua estrutura para alfa-TCP devido à temperatura superior a temperatura de transição de fase beta - alfa.


Figura 3 - TCP Comercial. TCP725PT: Calcinado a 725°C. TCP1330PT: Calcinado a 1330°C.

Figura 4 apresenta o difratograma do compósito poroso de hidroxiapatia com beta-TCP (HA+TCP PT) e os difratogramas isolados de beta-TCP (TCP PT) e da hidroxiapatita (HA PT) sinterizados a 1330°C. Neste caso como a temperatura de sinterização ultrapassou a temperatura de mudança de fase de beta para alfa-TCP tanto o difratograma do compósito (HA+TCP PT) quanto o difratograma do fosfato tricálcio (TCP PT) isolado apresentaram picos de alfa-TCP. A hidroxiapatita se manteve estável tanto no compósito quanto no difratograma isolado.

Com essa comparação é possível afirmar que no final do processo se tem um compósito de hidroxiapatita e alfa-TCP ao invés de hidroxiapatita e beta-TCP que era a composição inicial.


Figura 4 - Todas as amostras (PT) foram sinterizadas a 1330°C. (HA PT): Hidroxiapatita. (TCP PT): alfa-TCP. (HA+TCP PT): compósito-pastilha porosa.
Aplicando a equação de Scherrer (Eq.1 e Eq.2) nos dados adquiridos com a DRX foi possível obter o tamanho médio do cristalito da hidroxiapatita e do beta-fosfato tricálcio. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Como foi possível verificar, os resultados dos tamanhos de cristalitos das amostras estão compatíveis com as imagens de microscopia eletrônica, pois todas as amostras estão visualmente em escala nano, assim como os resultados obtidos com a equação de Scherrer, deve-se levar em consideração a tolerância de medida gerada pelas imagens de microscopia eletrônica, devido ao fato das partículas estarem aglomeradas. A amostra TCP calcinada a 725ºC obteve segundo cálculos da equação de Scherrer um tamanho de cristalito de 130 nm que segundo as imagens da Fig.2(b) representa o comprimento das agulhas, portanto a espessura pode ser considerada abaixo dos 100nm.


Tabela 1 – Resultados do cálculo do tamanho de cristalito, a partir da equação de Scherrer.

Amostras

Material comercial PT

HA (nm)

TCP (nm)

Calcinado 725ºC

63

130

Sinterizado 1330ºC

x

x

x: valor superior ao limite de calculo da equação.
Com a fluorescência de raios X foi possível identificar e semiquantificar os elementos que contaminam as amostras durante o processo, alguns podem estar presente na água e outros nos próprios reagentes. Os resultados obtidos estão na Tabela 2.

Os resultados de fluorescência monstraram que nenhum material aplicado neste trabalho apresentou elementos químicos considerados perigosos pela norma ASTM F 1185-03. Resultado este muito importante quando se trabalha com biomateriais.

Quando comparamos a hidroxiapatita com o fosfato tricálcio podemos dizer que ambos apresentaram 5 elementos de contaminação.

A hidroxiapatita e o fosfato tricálcio comercial apresentaram em sua composição química segundo FRX elementos como K, Na, Sr, S e Ni,



O TCP apresentou em suas análises valores de K e Na elevados quando comparados ao TCP sintetizado, porém, o S e o Ni obtiveram valores menores que a HA.
Tabela 2 - Resultados da análise semiquantitativa (materiais comerciais - fluidinova). Valores referentes à porcentagem em massa. A precisão do equipamento é de até 10-4.

Impurezas

Hidroxiapatita

Beta-Fosfato Tricálcio

Norma ASTM F1185-03

K

0,049

0,256

x

Na

0,011

0,171

x

Sr

0,007

0,012

x

S

0,021

0,012

x

Ni

0,006

0,005

x

As

ald

ald

0,0003

Cd

ald

ald

0,0005

Hg

ald

ald

0,0005

Pb

ald

ald

0,0030

ald: abaixo do limite de detecção.
A Figura 5(a) mostra em detalhes a porosidade interna do scaffold obtida a partir da fratura da estrutura. A Figura 5(b) apresenta poros do scaffold e por comparação com a escala da figura é possível constatar que o tamanho dos poros estão entre 100 e 600 micrômetros, tamanho um pouco acima do ideal indicado para o crescimento celular que é na faixa de 100 a 400micrômetros.


(a) (b)

Figura 5 - Pastilha calcinada a 1330°C. (a) Imagem da estrutura porosa interna obtida por estereoscópio. (b) Vista geral dos poros da superfície.
A estrutura porosa irregular da pastilha calcinada a 1330ºC apresenta uma superfície rugosa, com muitas arestas, mas sem cantos vivos acentuados, fato este constatado na Fig.6(a). A Figura 6(b) apresenta uma superfície com microporos e arestas com ângulos obtusos. Materiais com cantos arredondados são bons para a adesão celular, pois facilita a movimentação e fixação das células e os microporos também são bons para a fixação celular.


(a) (b)

Figura 6 - Pastilha calcinada a 1330°C. (a) Vista geral da microestrutura. (b) Detalhe da microestrutura com microporos.
A Figura 7 apresenta imagens do compósito em forma de pastilhas porosas sinterizadas a 1330ºC.

A Figura 7(a) apresenta a imagem 2D de uma fatia no interior da amostra obtida por um microtomógrafo e é possível visualizar a boa distribuição dos poros. A Figura 7(b) apresenta a projeção 3D do scaffold obtida por software pertencente ao equipamento Micro-CT, onde é possível visualizar a grande porosidade do scaffold. Neste caso a porosidade em alguns pontos como na extremidade da amostra possuem poucos poros e em outro como próximo ao centro a quantidade é excessiva. Este problema da distribuição de poros pode interferir na resistência mecânica do scaffold, no fluxo de sangue e distribuição de proteínas quando implantado.




(a) (b)

Figura 7 - Pastilhas porosas HA+TCP. (a) Microtomografia PT. (b) Imagem 3D.
A Tabela 3 mostrou que a amostra possui uma distribuição média dos poros por volta de 35% de porosidade com relação ao volume total do scaffold. Este valor abaixo dos 50% se deve a algumas regiões com poucos poros e foi possível constatar isto na imagem 3D do microtomógrafo Fig.7(b) essa diferença de porosidade distribuída no volume total do scaffold é ocasionada devido ao processo de compactação. Um fator que indica a provável redução da porosidade esperada é a espessura da estrutura da amostra foi de 168µm considerado um valor bom para resistência mecânica, porém interferiu diretamente na porosidade total. O valor obtido para o diâmetro médio dos poros foi de 937µm, valor esse não muito interessante se comparado com o ideal (100 a 400 micrômetros), porém quando se leva em consideração as imagens onde é possível verificar que existe a somatória de poros em algumas regiões, por isso é possível dizer que esse valor é aceitável.
Tabela 3 – Dados médios da porosidade, espessura da estrutura e diâmetro dos poros obtidos a partir dos resultados obtidos com a microtomografia computadorizada.

Amostras

Porosidade total (%)

Espessura da estrutura (µm)

Diâmetro dos poros (µm)

Scaffold PT

35  2

168  16

937  185

Com o picnômetro foram adquiridos dados de densidade média dos scaffolds (Tabela 4). Foi possível verificar que a densidade das pastilhas está relacionada com a quantidade dos materiais adicionados na câmara de compactação e a forma como foram compactados.


Tabela 4 - Valores médios de densidade obtidos a partir de três medições consecutivas realizadas por picnômetro.

Amostras

Densidade (g/cc)*

Scaffold PT

2,589  0,003

*desvio padrão em relação ao volume
Foi realizado o ensaio de MTT com células MG63 nas amostras após dois dias para verificar se as células conseguem aderir bem ao material e se elas se fixam também no interior dos scaffolds. A Figura 8 mostra o resultado do ensaio MTT, onde é possível visualizar células viáveis aderidas por toda a superfície (Fig.8a) e nos poros da pastilha (Fig.8b). Esse resultado indica que as células se adaptaram bem ao material, ao tipo de superfície, além de indicar que a porosidade foi adequada, pois existem células aderidas no interior dos poros.


(a) (b)

Figura 8 - Células MG63 aderidas à pastilha sinterizada a 1330°C, no 2°dia. (a) 6,3x de aumento. (b) 20x de aumento.

A Figura 9 mostra os resultados da cultura celular realizadas com células MG63 por 2 dias (Fig.9a) e 7 dias (Fig.9b) analisados por microscopia confocal.

Na Figura 9(a) (2 dias) é possível visualizar as células espalhadas pela superfície da amostra, porém ainda com seus filamentos retraídos deixando-as em forma esférica, mas já existem algumas células iniciando o processo de espraiamento.

Na Figura 9(b) (7 dias) é possível visualizar as células em detalhe. As células estão bem esticadas e grandes, além de algumas demonstrarem indícios de proliferação.




(a) (b)

Figura 9 - Células aderidas à pastilha calcinada a 1330°C observadas por microscopia confocal. (a) Cultivo de células por 2 dias. (b) Cultivo de células por 7 dias.
Este scaffold HA/TCP apresentou bons resultados no ensaio in vitro tanto no ensaio MTT quanto na microscopia confocal e que justificou a realização dos testes in vivo (Fig.10).

Os compósitos em forma de pastilhas cerâmicas porosas apresentaram boa adesão e proliferação celular em sua superfície e poros (Fig.8 e Fig.9), esse resultado obtido foi muito importante, pois prova que o material não é citotóxico. Os resultados in vivo (Fig.10) segundo imagens de histologia após os 56 dias de ensaio, foi verificado a presença de reação inflamatória crônica granulomatosa do tipo corpo estranho, tanto no scaffold com célula tronco mesenquimal, quanto no grupo controle onde foi implantado somente o scaffold. Essa reação é considerada normal para o período avaliado.

Normalmente nos ensaios in vivo em biomateriais ocorrem o encapsulamento fibroso nos materiais implantados, essa reação ao corpo estranho é considerada normal. A espessura do encapsulamento fibroso determina o quão compatível é o material, ou seja, quanto menor a espessura do encapsulamento mais biocompatível é o material e quanto maior a espessura menos biocompatível. Os fosfato de cálcio que foram os materiais utilizados neste trabalho também apresentam esse encapsulamento fibroso.

O que ocorre nos primeiros dias é uma resposta inflamatória aguda originada devido a trefina causar necrose no tecido adjacente ao defeito ósseo criado. O corpo hospedeiro reage gerando uma reação inflamatória aguda. No processo de reação inflamatória aguda, os leucócitos destroem o tecido danificado e enviam sinais aos macrófagos, que ingerem e digerem os antígenos e o tecido morto. A partir desta reação inflamatória inicial o organismo identifica o material implantado como “corpo estranho” e induzem uma reação inflamatória crônica do tipo corpo-estranho.




Figura 10 - Histologia da lamina do implante cultivado com células tronco mesenquimais.

4. CONCLUSÕES
Com as caracterizações de MEV, DRX e equação de Scherrer foi comprovado que os materiais de partida são nanopartículas de hidroxiapatita e fosfato tricálcio.

A fluorescência de raios X comprovou que as amostras possuem grau de pureza adequada para a aplicação como biomaterial segundo a norma ASTM F1185-03.

A microtomografia comprovou que o scaffold produzido possui quase 40% de porosidade em relação ao volume e a maioria dos poros são interconectados.

A cultura de células MG63 e as células tronco mesenquimais comprovaram com bons resultados que os scaffolds possuem potencial como biomaterial, pois foram considerados não citotóxicos, além das células apresentarem boa adesão e proliferação.


AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao consórcio Euro Brazilian Windows – Erasmus Mundus, External Cooperation Window (EBW), ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biofabricação (INCT BioFabris).
REFERÊNCIAS
1. Ben-Nissan, B.; Milev, A.; Vago, R. Biomaterials. 25, 20: 4971-4975, 2004.

2. Bueno, D.F. Tese de (Doutorado). Instituto de Biociências, USP, São Paulo, Brasil, 116p., 2007.

3. Bueno, D.F.; Sunaga, D.Y.; Gerson Shigeru Kobayashi, G.S.; Aguena, M.; Raposo-Amaral, C.E.; Masotti, C.; Cruz, L.A.; Pearson, P.L.; Passos-Bueno, M.R. Stem Cell Reviews and Reports. 7: 446–457, 2011.

4. Bueno, J.M.C. Tese de (Doutorado). Escola Politécnica da USP, São Paulo, São Paulo. 1987.

5. Costa, A.M., Bueno, D.F., Martins, M.T.; Kerkis, I.; Kerkis, A.; Fanganiello, R.D.; Cerruti, H.; Alonso, N.; Passos-Bueno, M.R. Journal of Craniofacial Surgery. 19, 1: 204–210, 2008.

6. Fahlman, B.D. Springer, Dordrecht. The Netherlands, 2007, Cap. 6, Nanomaterials, pp. 275-356.

7. KAMBLE, R.B., MATHE, V.L. Sensors and Actuators B. 131: 205-209, 2008.

8. Laranjeira, M.S.; Fernandes, M.H.; Monteiro, F.J. Journal of Biomedical Materials Research A. 95a, 3: 891 – 900. 2010.

9. Nag, M., Basak, P., Manorama, S. V. Materials Research Bulletin. 42: 1691-1704, 2007.

10. Pechini, M. P. United States Pattent Office – 3,330,697, 1967.

11. Penolazzi, L.; Mazzitelli, S.; Vecchiatini, R.; Torreggiani, E.; Lambertini, E.; Johnson, S.; Badylak, S.F.; Piva, R.; Nastruzzi, C. Journal of Cellular Physiology. 227, 2: 857-866, 2012.

12. Pinheiro, E.A. Tese de (Doutorado). Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo. 1992.

13. Quina, F.H. Química nova. 27, 6, pp.1028-1029, 2004.

14. Rodrigues, L. R.; Dias, C.G.B.T.; Monteiro, F.J.M.; Zavaglia C.A.C. 21st International Congress of Mechanical Engineering, 2011, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil.

15. Rodrigues, L.R. 2008. Dissertação de (Mestrado). Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil, 92p., 2008.

16. Sagawa, H.; Itoh, S.; Wang, W.; Yamashita, K. Artificial Organs. 34, 6: 491-497, 2010.

17. Salerno, A.; Guarnieri, D.; Iannone, M.; Zeppetelli, S.; Netti, P. A. TISSUE ENGINEERING: Part A. 16, 8: 2661-2673, 2010.

18. Sharma, M.K.; Shah, D.O. In macro and microemulsions: theory and applications. Sha, D.O. (Ed.). Washington, D.C.: American Chemical Society, (ACS Symposium Series, Vol. 272), 1985.

19. Small, D.M. Journal Colloid interface Science, 58: 3; 581- 602, 1977.

20. Souza, E.A.; Duque, J.G.S.; Kubota, L.; Meneses, C.T. Journal of Physics and Chemistry of Solids. 68, 594-599, 2007.

21. Thimm, B.W.; Wüst, S.; Hofmann, S.; Hagenmüller, H.; Müller, R. Acta Biomaterialia. 7: 2218–2228, 2011.

22. Toumey, C. Apostolic Succession: Does Nanotechnology Descend from Richard Feynman’s 1959 Talk? Engineering and Science. 68,1: 16-23, 2005.




CULTURING MESENCHYMAL STEM CELLS ON CALCIUM PHOSPHATE SCAFFOLD: IN VITRO AND IN VIVO ASSAYS
Rodrigues, L.R.1,2,3,4,5; Almeida, A.B.A6; Feliciano, D.F.1,2,6; Raposo-Amaral, C.E.6; Passos-Bueno, M.R.7; Bueno, D.F.7; Alamada, B.V.P.6; Fernandes, M.H.5; Monteiro, F.J.M. 3,4 and Zavaglia, C.A.C. 1,2
1 Department of Materials Engineering, Faculty of Mechanical Engineering, State University of Campinas, Campinas, (SP), Brazil;

2 National Institute of Science and Technology in Biofabrication, Campinas, (SP), Brazil;

3 Departamento de Engenharia Metalúrgica e Materiais, Faculdade de Engenharia, Universidade do Porto, Porto, Portugal;

4 INEB- Instituto de Engenharia Biomédica, Porto, Portugal;

5 Laboratório de Farmacologia e Biocompatibilidade Celular, Faculdade de Medicina Dentária (FDMUP), Universidade do Porto, Porto, Portugal;

6 SOBRAPAR - Institute of Craniofacial and Plastic Surgery, Campinas, (SP), Brazil.

7 Department of Genetics and Evolution Biology, Institute of Bioscience, USP, (SP), Brazil.

E-mail: leo5002@fem.unicamp.br




Abstract. Nanotechnology and tissue engineering together are bringing new hopes in treatment of diseases previously incurable, because they are areas covering several multidisciplinary studies in the field of regenerative medicine in order to treat a large number of diseases, and are created new tactics for recovery a lost tissue by accident. We were chosen for these work calcium phosphates nanoparticles. The calcium phosphates were chosen for their similarity with mineral phase of bone tissue and we decided to use nanoparticles because of better properties resulting on composites materials. Hydroxyapatite induces bone growth and alpha-TCP in contact with body fluid forms cement which improves the strength of scaffold. The scaffold was produced in porous cylinder form. The porous ceramic cylinders were seeded with mesenchymal stem cells and implanted in rats to investigate the behavior of cells in the scaffold when in contact with bone tissue. The particles were characterized using X-ray diffraction (XRD), Scherrer equation, X-ray fluorescence (XRF) and environmental scanning electron microscopy (ESEM). The porous ceramics cylinders were characterized using XRD, ESEM, pycnometer, Micro-CT, MTT assay and confocal microscopy. Histological analysis was made from slides with the tissue formed.
Keywords: Hydroxyapatite, tricalcium phosphate, tissue engineering, mesenchymal stem cells, in vivo assay.

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