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Disciplina de Biociências I ( DB-110 )

Bioquímica

Aula Prática 4




Enzimologia
Material: saliva diluída 5 vezes; amido 1% em NaCl 0,1 M; iodo; HCl 0,4%; ácido láctico 0,1%; NaOH 0,4%; Reativo de Benedict; Banho Maria a 4ºC, 37ºC e 100ºC.
I - Ensaio Qualitativo da Amilase Salivar

1. Coletar saliva,filtrando-a.

2. Diluir 5 vezes da seguinte maneira: 1,0 mL de saliva + 4,0 mL de água destilada e deionizada (água dd).

3. Aos 6 tubos de ensaio enumerados de 0 ( zero ) a 5 ( cinco ) , adicionar 2 gotas de iodo a cada um.

4. Colocar o erlenmeyer contendo 50 mL de amido 1% no banho maria a 37ºC por 5 minutos, para que a temperatura da solução se iguale à do banho maria.

5. Adicionar então 1,0 mL de saliva diluída ao erlenmeyer, que está no banho maria, agitar e imediatamente retirar uma alíquota de 3,0 mL, transferindo para o tubo 0 ( zero ). Acrescentar também a este tubo 3,0 mL de água dd.

6. Continuar seqüencialmente de 2 em 2 minutos retirando alíquotas de 3,0 mL de amostras do erlenmeyer e transferindo para os outros tubos numerados. Acrescentar aos tubos 3,0 mL de água dd após cada coleta das alíquotas.

7. Interromper a coleta de alíquotas ao atingir o ponto acrômico, que corresponde à cor do iodo em água ( tubo água dd + iodo ).



Obs.: Poderá ser necessário coletar mais alíquotas do que descrito no roteiro.

Tubo

Água dd + iodo

tubo 0

tubo 1

tubo 2

tubo 3

tubo 4

tubo 5

Cor






















II - Efeito do pH, temperatura e cofator na atividade enzimática: Enumerar 06 tubos de ensaios grandes e adicionar aos mesmos 2,0 mL das seguintes soluções:




Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Soluções

HCl
0,4%

ácido láctico 0,1%

água dd

NaOH 0,4%

água dd

água dd

amido com Cl-

amido sem Cl-

Adicionar a cada tubo 0,1 mL de saliva diluída 5 vezes e agitar

Temperatura

Banho Maria a 37ºC

4ºC

100ºC

37ºC

Após 5 minutos, adicionar 2,0 mL de amido a 1% ( exceto no tubo 7 e 8 ), mantendo nas respectivas temperaturas.

Agitar e aguardar o tempo obtido para atingir o ponto acrômico do experimento I.

Após este tempo, retirar 0,25 mL de cada tubo e transferir para outros tubos com a mesma numeração ( porém de tamanho menor ). Na solução que sobrou nos tubos maiores, fazer o teste do iodo (adicionar 2 gotas de iodo) e nos tubos pequenos fazer a reação de Benedict.

Resultado teste do iodo

























Interpretação

























REAÇÃO DE BENEDICT ( tubos pequenos ): Adicionar a cada tubo 0,75 mL do Reativo de Benedict e colocar em banho maria fervente por 5 minutos. Anotar os resultados.




Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tubo 8

Resultados

























Interpretação


























III - Desnaturação Irreversível da amilase por agentes químicos: ( demonstração )




Tubo 01

Tubo 02

Amido

3,0 mL

3,0 mL

cloreto de mercúrio (HgCl2)

0,5 mL

---

Saliva diluída

0,1 mL

0,1 mL

Colocar no banho maria a 37ºC pelo tempo obtido para atingir o ponto acrômico

Iodo

5 gotas

5 gotas

Resultados







Interpretação






Perguntas para a discussão:



  1. Qual a função da amilase presente na saliva?

  2. Que fatores desnaturantes foram avaliados na aula prática?

  3. Sendo a amilase uma proteína, quais estruturas foram afetadas na desnaturação?

  4. Como a desnaturação afeta a função desta enzima?

  5. Quais são as duas maneiras de se determinar a atividade enzimática?

  6. Qual o papel do iodo na identificação do amido?

  7. Por que foi feita a reação do Biureto?

  8. Como o cloreto de mercúrio inibe a ação da amilase?

Profa. Dra. Cínthia P. Machado Tabchoury Técs: Sr. Waldomiro Vieira Filho

Prof. Dr. Jaime A. Cury Sr. José Alfredo da Silva . Estagiários: Srta. Greice Joseane R. Toledo

Sr. Antônio Carlos Lopretti Neto



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