Metodologia para avaliação, em casa-de-vegetação, da resistência de genótipos de soja à pústula bacteriana Xanthomonas axonop



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MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUARIA E ABASTECIMENTO.

SECRETARIA DE DESENVOLVIMENTO AGROPECUÁRIO E COOPERATIVISMO

DEPART. DE PROPRIEDADE INTELECTUAL E TECNOLOGIA AGROPECUARIA

SERVIÇO NACIONAL DE PROTEÇÃO DE CULTIVARES




ANEXO II


INSTRUÇÕES PARA EXECUÇÃO DOS ENSAIOS DE DISTINGUIBILIDADE, HOMOGENEIDADE E ESTABILIDADE DE CULTIVARES DE SOJA (Glycine max (L.) Merrill)

INTRODUÇÃO


Nos dias 04, 05 e 06 de junho de 2007 reuniram-se nas dependências do MAPA), a convite do Serviço Nacional de Proteção de Cultivares – SNPC/DEPTA/SDC, técnicos do MAPA, fitopatologistas e melhoristas de soja, com o objetivo de revisar as características de doenças constantes nos descritores mínimos oficiais utilizados na realização de ensaios de Distinguibilidade, Homogeneidade e Estabilidade – DHE para a espécie.

Participaram da reunião: Ademir Henning (Embrapa Soja); Alexei Dianese (Embrapa Cerrados); Álvaro Almeida (Embrapa Soja); Carlos Renato da Rosa (Pioneer); Claudete Teixeira Moreira (Embrapa Cerrados); Daniela de Moraes Aviani (SNPC/MAPA); Ériko Tadashi Sedoguchi (DPCP/MAPA); Francisco Jose Mitidieri (CGZA/MAPA); Gabriela C. G. Andrade (Monsanto); Gisele Ventura G. Grilli (SNPC/MAPA); Helinton J. Rocha (DEPTA/MAPA); João Flávio V. Silva (Embrapa Soja); José Tadashi Yorinori (FMT/TMG); Laércio Zambolim (UFV); Luis Gustavo Asp Pacheco (SNPC/MAPA); Marcos Norio Matsumoto (Monsanto); Maria Telza Ávila Bastos (LADIC); Renata Jung (Pioneer); Ricardo Zanatta Machado (SNPC/MAPA); Ronir Carneiro (DEGER/MAPA); Sérgio H. Brommonschenkel (UFV); Tatiane Dalla Nora (COODETEC); Tito Goldenberg (RNC/MAPA); Sandra Kunieda de Alonso (DEPTA /MAPA); Vera Lúcia dos S. Machado (SNPC/MAPA); Waldir Pereira Dias (Embrapa Soja) e Zaira M. de Melo Azedo (RNC/MAPA).

Entre os pontos discutidos na reunião, tratou-se da necessidade de padronização dos protocolos utilizados para cada doença bem como dos termos utilizados para descrever os níveis de expressão de doenças. Foram identificadas ainda as doenças que deveriam ser de caráter obrigatório nos descritores, enquanto que as doenças com ocorrência em regiões específicas do Brasil seriam consideradas características adicionais.

Os protocolos foram formulados pelos fitopatologistas especializados em cada tipo de patógeno e submetidos à aprovação do grupo.

O SNPC realizou, então, consulta a várias instituições indicadas pelos participantes, com a finalidade de verificar a possibilidade de execução dos protocolos de doença. Foram enviados questionários a cinco instituições sugeridas pelo grupo, questionando quanto à possibilidade de: (a) prestação do serviço; (b) capacitação de técnicos na execução dos protocolos; e (c) manutenção das fontes de inóculo e das hospedeiras diferenciadoras. Para haver harmonização nos resultados de testes de fitopatologia realizados por diferentes empresas em diferentes locais e anos é fundamental a centralização da manutenção das fontes de inóculo. A Embrapa Soja foi a única entre as instituições contatadas que informou manter todas as fontes de inóculo das doenças obrigatórias presentes nos descritores de soja.

É importante notar, ainda, que os níveis de expressão utilizados nos protocolos, e acordados entre os participantes do presente trabalho, seguem o padrão preconizado pela UPOV – União Internacional para a Proteção das Obtenções Vegetais (da qual o Brasil é membro), os quais são divididos em três níveis para características quantitativas: suscetível, moderadamente resistente e altamente resistente.

Os protocolos foram reunidos no presente documento, que foi apresentado na 4ª Reunião Técnica de Avaliadores de Soja, realizada em 18 de maio de 2009, em Goiânia/GO.


PROTOCOLOS PARA AVALIAÇÃO DE REAÇÃO ÀS DOENÇAS

ÍNDICE




Características 23 e 34. Reação à pústula bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 3

Característica 25. Reação à mancha "olho-de-rã" (Cercospora sojina) 7

Característica 26. Reação ao cancro da haste (Phomopsis phaseoli var. meridionalis/Diaporthe phaseolorum var. meridionalis) 10

Característica 27. Reação à necrose da haste (Cowpea mild mottle virus) 13

Característica 28. Reação ao nematóide de galhas (Meloidogyne javanica) 14

Característica 29. Reação ao nematóide de galhas (Meloidogyne incognita) 15

Característica 31. Reação ao vírus do mosaico comum da soja (VMCS - Soybean mosaic virus) 16

Caracteristicas 30, 32 e 33. Reação ao nematóide de cisto da soja (Heterodera glycines) 17

Característica 35. Reação à podridão parda da haste (Cadophora gregata, sin. Phialophora gregata) 18

Característica 36. Reação à mancha alvo (Corynespora cassiicola) 19

Característica 37. Reação à podridão radicular de fitóftora (Phytophthora sojae) 22




Características 23 e 34. Reação à pústula bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. glycines)

Rafael Moreira Soares

Embrapa Soja, Londrina, PR



  1. Natureza do controle genético da resistência à doença

A resistência é governada por um gene recessivo que confere resistência vertical. Apesar disto, tem se verificado reações quantitativas, com níveis intermediários de resistência/suscetibilidade.

  1. Informação sobre os patótipos da doença

A literatura cita a existência de pelo menos 5 raças do patógeno.

  1. Fonte(s) de inóculo da doença

Instituto Biológico/Laboratório de Bacteriologia Vegetal, Caixa Postal 70, CEP 13001-970, Campinas, SP.

  1. Conjunto de hospedeiras diferenciais

Não existe citação de materiais padrões para diferenciação.

  1. Método para manutenção do inóculo da doença

Aconselha-se utilizar mais de um método de manutenção e preservação do inóculo. Entre eles: coleta e armazenamento de folhas infectadas, repicagem periódica em tubos com meio NA inclinado, preservação por secagem em tiras de papel-filtro, preservação em água destilada estéril e preservação em glicerina.

  1. Metodologia para execução do teste de resistência/suscetibilidade

Preparo do inóculo

O isolado da bactéria deve ser cultivado, na forma de estrias, em tubos com meio inclinado ou placas de Petri, utilizando meio de cultura Nutriente Ágar (NA)(extrato de carne, 3g; peptona, 5g; ágar, 15g; água destilada, 1L). Desse cultivo, faz-se uma suspensão que será vertida em placas de Petri (200 a 350 µL/placa) com NA. O tempo de cultivo varia de 2 a 4 dias, mantendo-se entre 25 e 28°C, no escuro.



Característica 23: Teste em casa-de-vegetação

Inoculação

A inoculação será feita preparando-se uma suspensão da bactéria em água ou solução salina (NaCl a 0,85%), com concentração aproximada de 108 ufc/mL, o que equivale aproximadamente a diluição do cultivo de 01 placa de Petri completamente coberta pela bactéria, em 100 mL de água. As plantas devem estar com no mínimo 15 dias de cultivo. Essa suspensão será inoculada em folhas de acordo com o seguinte procedimento: molhar um pincel (tamanho 3/4”- 19mm) na suspensão da bactéria e passá-lo na superfície inferior da folha. Deve-se cortar a ponta das cerdas do pincel para torná-las mais abrasivas, mas passar o pincel levemente para não ferir em demasia a folha (assim, este método possibilidade a ocorrência de sintomas semelhantes a infecção natural). As plantas devem estar em ambiente com temperatura em torno de 28 °C e alta umidade relativa ou podem ser mantidas em câmara úmida por 24 horas após a inoculação.



Avaliação

Deve ser feita em torno de 10 dias após a inoculação, observando-se o desenvolvimento da bactéria nos tecidos foliares. As reações devem ser classificadas em suscetível (S), moderadamente resistente (MR) ou resistente (R). Utilizar a cultivar BRS 133 (ou outra com reação igual) como padrão de resistência, e um padrão de suscetibilidade (sugestões: PI 340899, PI 587886)

Observar o escurecimento do tecido, com bordos amarelados, a partir dos ferimentos do pincel e do aparecimento de pústulas. Quanto maior o escurecimento e aparecimento de pústulas, maior a suscetibilidade. A ausência do escurecimento e de pústulas indica resistência.
Característica 34: Teste para “resistência de campo”

O teste pode ser realizado em casa de vegetação ou no campo. A metodologia consiste em pulverizar uma suspensão da bactéria em água com concentração aproximada de 108 ufc/mL, o que equivale aproximadamente a diluição do cultivo de 1 placa de Petri completamente coberta pela bactéria, em 100mL de água. A inoculação (pulverização) deve ser feita em torno de 30 dias após a semeadura. É importante observar os seguintes fatores:

- no momento da pulverização deve haver bastante umidade no solo, de forma que a planta não esteja sofrendo estresse por falta de água, e deve ser com temperatura amena, de preferência no final da tarde.

-se entre 10 e 15 dias não houver sintomas da doença, a pulverização deverá ser repetida.

-devem ser semeadas linhas da testemunha suscetível entre as linhas, e/ou na bordadura, das cultivares a serem testadas;

-no caso de teste no campo, a semeadura deverá ser feita o mais cedo possível para evitar incidência de ferrugem. Caso seja necessário, aplicar fungicida para controle.

A avaliação deverá ser feita quando a testemunha suscetível atingir níveis consideráveis de infecção. Os sintomas são pequenas lesões negras circulares com halo amarelo ao redor, que na face inferior da folha apresentam o centro com coloração mais clara e saliente (pústula) (ver fotos). As reações devem ser classificadas, tomando como padrão a testemunha suscetível, em: suscetível (S)(muitas lesões), moderadamente resistente (MR)(poucas lesões) ou resistente (R)(sem lesões).
Referência Bibliográfica:

Romeiro, R.S. Métodos em bacteriologia de plantas. Viçosa: UFV, 2001. 279p.





  1. Diferentes níveis de expressão de resistência a doença





Figura 1. Exemplo de sintomas – inoculação com método do pincel








Pústula bacteriana – face superior da folha








Pústula bacteriana – face inferior da folha

Figura 2. Exemplos de plantas suscetíveis com inoculação por pulverização no campo


Característica 25. Reação à mancha "olho-de-rã" (Cercospora sojina)

José Tadashi Yorinori

Tropical Melhoramento e Genética -TMG, Cambé, PR
O presente protocolo se aplica a dois testes com misturas de raças diferentes. O primeiro deve conter inóculos das raças Cs-2, Cs- 4, Cs-7 e Cs-15 e o segundo mistura das raças Cs-23, Cs-24 e Cs-25). Os testes são realizados com plantios em vaso, em casa de vegetação. Cada cultivar será semeada em um vaso contendo cerca de 4kg de solo, com 15-20 sementes e deverá ter, no mínimo, 10 plantas viáveis para teste. As plantas serão inoculadas nos estádios V4-V5 (3 a 4 trifólios) com suspensões de conídios produzidos em laboratório, na concentração de 1,0-1,5 x 104 conídios/ml. A produção do inóculo será feita em meio de cultura contendo extrato de tomate (280g) + agar (17g) + carbonato de cálcio (4,5g) + água destilada para completar um litro. As plantas inoculadas são mantidas em casa de plástico van der Hoeven, sob umidade próxima da saturação por 48 horas, com nebulização automática, à temperatura de 25-28º C.

A avaliação da reação de cada cultivar é feita aos 21-25 dias após a inoculação. Em cada uma das 10 plantas mais infectadas no vaso, é considerado o folíolo mais infectado e feitas as avaliações com o seguinte critério de discriminação das reações:




  1. Tipo (tamanho ou diâmetro) predominante de lesões ou manchas (TL), que variam de 1mm a 5mm.




  1. Nível de infecção (NI) e porcentagem de área foliar infectada (% a.f.i.)

NI O = 0% = Ausência de sintoma

NI 1 = traços a 10 % a.f.i.

NI 2 = 11 % a 25 % a.f.i.

NI 3 = 26 % a 50% a.f.i.

NI 4 = 51 % a 75 % a.f.i.

NI 5 =  75% a.f.i.
C. A reação final de cada cultivar a ser descrita será baseada na predominância dos tipos de lesões (TL) e do nível de infecção (NI):


Reação

NI

TL (mm)

R = Resistente

0

0

MR= Moderadamente resistente

1 a 2

1 a 3

S = Suscetível

3 a 5

>3







Figura 1 A - NI = 4-5 (>75% a.f.i.), TL = 2 a 4 (S)

Figura 1 B - TL = 5 (S), com intensa esporulação

A seguir são apresentados os diferentes tipos de reações e os níveis de severidade causados pela mancha “olho-de-rã” (Figs. 2 a 5).








Figura 2 A - Foliolo sem sintoma; NI = 0 (“imune”)(R)

Figura 2 B –NI = 1 (<10%); TL = 1 a 3 (R)








Figuras 3 A e B – A (superior): “o.d.rã” NI = 3 (35-40% a.f.i.); TL = 1 a 3 (I); B (inferior): NI = 3 (35% a.f.i.); TL = 2 a 4 (S)






Figuras 4 A e B – A (superior): “o.d.rã” NI = 4 (55-60% a.f.i.), TL = 1 a 5 (S); B (inferior): NI = 4 (52% a.f.i.); TL = 3 a 5 (S)







Figuras 5 A e B – A (superior): “o.d.rã” NI = 3 (35-40% a.f.i.), TL = 3 a 5 (S); B (inferior): NI = 5 (>75% a.f.i.); TL = 4 a +5 (S)


Característica 26. Reação ao cancro da haste (Phomopsis phaseoli var. meridionalis/Diaporthe phaseolorum var. meridionalis)

José Tadashi Yorinori



Tropical Melhoramento e Genética -TMG, Cambé, PR
O teste é feito em casa de vegetação. O método de inoculação utilizado é o do palito-de-dente, adaptado de Keeling (Phytopathology 72:807-809. 1982).
Preparo do inóculo: O fungo é cultivado em placa de petri contendo meio de batata-dextrose-agar (BDA), onde são colocados de 50 a 150 palitos-de-dente. Os palitos são de madeira de pinho, de formato cilíndrico. Inicialmente devem ser fervidos com duas trocas de água, a fim de eliminar a resina. Após secar, são cortados em ¼ do tamanho normal e apontados em uma das extremidades. Os palitos são espetados em uma folha de papel sulfite, tendo como guia uma chapa metálica perfurada. O papel com os palitos é cortado no diâmetro da placa de petri. Posteriormente, os discos com os palitos são colocados em placas de petri esterilizados em autoclave ou estufa a 120ºC. O meio de cultura (BDA) é então vertido na placa contendo os palitos e a quantidade de meio de cultura deve ser tal que apenas 3 a 4 mm da extremidade afinada do palito, na posição vertical, fique fora do meio. Após o preparo da placa com o meio de cultura e os palitos, são colocados por placa, cinco a seis discos de inóculo do fungo com 4 a 5 dias de idade. As placas inoculadas são incubadas em uma câmara de incubação à temperatura de 23 - 25oC, durante 5 a 7 dias, estando prontas para uso após esse período. Para que os testes tenham resultados uniformes, é importante que os palitos estejam totalmente cobertos de micélio (Figs. 1 A e B).







Figuras 1 A e B: método de produção do inóculo de Ph.p./D.p. var. meridionalis (e var. caulivora) com palito-de-dente, em meio de BDA



Cultivo das plântulas: As cultivares a serem testadas são plantadas em vasos contendo cerca de 4 kg de solo. Em cada vaso são colocadas suficientes sementes de modo a ter 10-15 plantas. De cada cultivar ou linhagem são inoculadas 10-15 plântulas, as quais representarão cada cultivar.
Inoculação: entre 11 a 15 dias após a semeadura, as plântulas são inoculadas espetando-se o palito-de-dente colonizado cerca de 1cm abaixo do nó cotiledonar. O palito é inserido na haste até que se possa senti-lo do outro lado do cilindro da haste, porém, sem atravessá-lo totalmente (Figs. 2 A e B). Após a inoculação, as plântulas são mantidas sob condição de umidade próxima à saturação, com asperções intermitentes, durante um mínimo de 48 horas.






Figuras 2 A e B: inoculação com palito-de-dente colonizado pelo fungo do cancro da haste



Avaliação: A leitura das reações é feita entre 21 e 25 dias após a inoculação, adotando-se o seguinte critério (Figs. 3 - 6):
S = Plântula sadia: com leve ou nenhuma necrose acima e abaixo do ponto de inoculação, sem nenhum sintoma de murcha ou clorose da folha unifoliolada.
PI = plântula infectada: com necrose estendendo-se até cerca de 1cm acima e abaixo do ponto de inoculação, mostrando apenas amarelecimento, murcha ou necrose da folha unifoliolada, com aparente desenvolvimento normal da parte superior.
PM = plântula morta: plântula com extensa necrose acima e abaixo do ponto de inoculação, com seca, murcha ou amarelecimento da folha unifoliolada, clorose e/ou necrose internerval das folhas superiores e reduzido desenvolvimento ou até morte da plântula (Figs. 3 - 6).
Classificação das reações: A classificação das reações de cada linhagem/cultivar é baseada na porcentagem de plântulas mortas (PM %), calculada conforme a seguinte fórmula:
PM % = (PM + PI/2) 100/TP, onde:
PM % = porcentagem de plântulas mortas;

PM = número de plântulas mortas/vaso

PI = número de plântulas infectadas; cada plântula infectada é considerada equivalente à meia plântula morta; e

TP = total de plântulas avaliadas (10 a 15).
Reação da cultivar: a reação final na cultivar é baseada na percentagem de plântulas mortas, obedecendo o seguinte critério:
R = Resistente: de 0% a 25% PM

MR = Moderadamente resistente: de 26% a 50% PM

S = Suscetível: acima de 50% PM
Testes cujos resultados de % PM na cultivar padrão de suscetibilidade forem inferiores a 80% devem ser descartados e repetidos.
Padrões: Suscetíveis: BRAGG, BR 23, COBB; Resistentes: Conquista, CD 201






Figuras 3 A e B: reação ao cancro da haste após 10-15 dias da inoculação com palito-de-dente








Figuras 4 A e B – A (superior): sintoma de amarelecimento do unifoliolado que indica reação PI (plântula apenas infectada) e B (inferior): reação de resistência e suscetibilidade no mesmo vaso








Figuras 5 A e B - A: reação dos padrões de resistência e de sucetibilidade (cv. BR-23); B: reação da BR-23 (padrão suscetível) e linhagem resistente em teste








Figuras 6 A e B: diferenciação de níveis de suscetibilidade (ou resistência) ao cancro da haste entre linhagens e o padrão suscetível (BR-23)



Característica 27. Reação à necrose da haste (Cowpea mild mottle virus)


Álvaro M. R. Almeida

Embrapa Soja, Londrina, PR




  1. Idade de Inoculação: as plantas a serem inoculadas mecanicamente têm a primeira folha trifoliada completamente desenvolvida e o segundo trifólio, em desenvolvimento.

  2. Inoculação: inicialmente polvilham-se as folhas trifoliadas e primárias com carvão vegetal, finamente moído. O inóculo é constituído de extrato de folhas infectadas, moídas na presença de tampão fosfato de potássio (ou sódio) 0,001M pH 7,0.

O extrato infectivo é esfregado sobre o limbo foliar previamente polvilhado com carvão. Após isso, e no final da inoculação das plantas, lava-se levemente as folhas com água para retirar o excesso de extrato e carvão. Recomenda-se utilizar no mínimo 40 plantas por cultivar.

  1. Avaliação: é feita cerca de 3-4 semanas após a inoculação, observando-se as folhas do terço superior, anotando-se o número de plantas por classe de sintomas (1 a 4) segundo escala gráfica:

1= sem sintomas;

2= leve clorose e leve clareamento de nervuras;

3= evidente clareamento de nervuras e/ou mosaico;

4= folhas com formação de bolhas, encarquilhadas e/ou com necrose sistêmica.


A determinação da reação da cultivar será feita de acordo com a seguinte escala:

- até 10% do total de plantas inoculadas com nota 3 e 4, tem-se reação resistente (R)

- de 10,1 % a 30% tem-se reação moderadamente resistente (MR)

- maior do que 30,1%, tem-se reação suscetível (S)






Figura 1. Classes de sintomas em folhas de soja, causados pelo “Cowpea mild mottle virus”. 1= folhas do terço superior sem sintomas ou com leve amarelecimento; 2= folhas apresentando clareamento de nervuras e/ou mosaico; 3= folhas com formação de bolhas, encarquilhadas e/ou com necrose sistêmica



  1. Controle: utilizar plantas de soja da cv. CD 206 (suscetível) e cv. BRSMT Pintado (resistente) para confirmar a eficiência da inoculação ou contaminação com outro vírus.

Característica 28. Reação ao nematóide de galhas (Meloidogyne javanica)

Waldir Pereira Dias

Embrapa Soja, Londrina, PR
As cultivares a serem testadas, mais os padrões de resistência (PI 595099, ‘CD 201’, ‘CD 208’, ‘MG/BR 46 Conquista’, e ‘BRS Celeste’, dentre outros) e de suscetibilidade (‘BRSMT Pintado’, ‘BRS 133’ e ‘Embrapa 20’ , dentre outros) são germinados em areia e transplantados (6 plântulas/cultivar) para tubetes plásticos (1 plântula/tubete) contendo mistura estéril de solo e areia (1:3). Dois dias após o transplantio, cada plântula é inoculada com 5.000 ovos e juvenis de segundo estádio de uma população pura do nematóide multiplicada em tomateiro ‘Santa Cruz’ ou numa cultivar de soja suscetível. Os tubetes assim preparados, são mantidos em casa de vegetação com temperatura de 25-300C por 45-60 dias. Decorrido esse período, cada planta é cuidadosamente retirada do recipiente e, lavado o excesso de terra das raízes, recebe uma nota (0 a 5) de acordo com a intensidade de galhas no sistema radicular. Zero significa ausência de galha e 5 a intensidade máxima. Cultivares com nota (média das seis repetições) até 2 são taxados como resistentes, de 2 a 3 como moderadamente resistentes, e acima de 3 como suscetíveis. Na atribuição das notas, sempre levar em consideração o comportamento dos padrões.


Característica 29. Reação ao nematóide de galhas (Meloidogyne incognita)

Waldir Pereira Dias

Embrapa Soja, Londrina, PR
As cultivares a serem testadas mais os padrões de resistência (PI 595099, ‘CD 201’, ‘CD 202’, ‘CD 208’ e ‘MG/BR 46 Conquista’, dentre outros) e de suscetibilidade (‘BRS Celeste’, ‘Santa Rosa’, ‘BRSMT Pintado’, ‘BRS 133’ e ‘Embrapa 20’, dentre outros) são germinados em areia e transplantados (6 plântulas/cultivar) para tubetes plásticos (1 plântula por tubete) contendo mistura estéril de solo e areia (1:3). Dois dias após o transplantio, cada plântula é inoculada com 5.000 ovos e juvenis de segundo estádio de uma população pura do nematóide multiplicada em tomateiro ‘Santa Cruz’ ou numa cultivar de soja suscetível. Os tubetes assim preparados, são mantidos em casa de vegetação com temperatura de 25-300C por 45-60 dias. Decorrido esse período, cada planta é cuidadosamente retirada do recipiente e, lavado o excesso de terra das raízes, recebe uma nota (0 a 5) de acordo com a intensidade de galhas no sistema radicular. Zero significa ausência de galha e 5 a intensidade máxima. Cultivares com nota (média das seis repetições) até 1 são taxadas como resistentes, de 1 a 2 como moderadamente resistentes, e acima de 2 como suscetíveis. Na atribuição das notas, sempre levar em consideração o comportamento dos padrões.








Nota 0 (zero)

Nota 1

Nota 2










Nota 3

Nota 4

Nota 5


Característica 31. Reação ao vírus do mosaico comum da soja (VMCS - Soybean mosaic virus)

Álvaro M. R. Almeida

Embrapa Soja, Londrina, PR


  1. Manutenção do inóculo: o inóculo utilizado é denominado MS-1, sendo a estirpe mais prevalente no Brasil e mantido em casa de vegetação em plantas de soja, cv. Santa Rosa. O vírus é mantido no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Soja em sementes da cv. Santa Rosa.

  2. Idade de Inoculação: as plantas a serem inoculadas mecanicamente devem ter a primeira folha trifoliada completamente desenvolvida e o segundo trifólio em desenvolvimento.

  3. Inoculação: inicialmente polvilham-se as folhas trifoliadas e primárias com carvão vegetal, finamente moído. O inóculo é constituído de extrato de folhas infectadas, moídas na presença de tampão fosfato de potássio (ou sódio) 0,01 M pH 7,0.

O extrato infectivo é esfregado sobre o limbo foliar previamente polvilhado com carvão. Após isso, e no final da inoculação das plantas, lava-se levemente as folhas com água pura para retirar o excesso de extrato e carvão. Utiliza-se 20 plantas por cultivar. As condições de temperatura não podem exceder 35°C.

  1. Avaliação: é feita cerca de 2-3 semanas após a inoculação, observando-se sintomas de: a) mosaico (suscetível) ou b) necrose sistêmica (resistente).

  2. Padrões de suscetibilidade e resistência: plantas de soja da cv. Santa Rosa e cv. CD 202, consideradas suscetível e resistente, respectivamente, são sempre utilizadas para confirmar a eficiência da inoculação ou contaminação com outro vírus.



Caracteristicas 30, 32 e 33. Reação ao nematóide de cisto da soja (Heterodera glycines)

Waldir Pereira Dias

Embrapa Soja, Londrina, PR
Germinar em areia sementes das cultivares a serem testadas, juntamente com as diferenciadoras de raças ('Pickett', 'Peking', PI 88788, PI 90763 e ‘Hartwig’) e dos padrões de suscetibilidade (‘Lee 74’) e de resistência (PI 437654). Dois dias após a emergência, são transplantados (6 plântula/cultivar) para vasos de argila (1 plântula/vaso) contendo mistura estéril de solo e areia (1:3). Simultaneamente ao transplantio, cada plântula é inoculada com 4.000 ovos da raça a ser testada do nematóide de cisto . Os vasos, assim preparados, são mantidos em casa de vegetação com temperatura entre 25-30OC por 28-30 dias. Decorridos esse período, cada plântula é retirada do vaso e tem seu sistema radicular lavado sob jato forte de água, sobre peneira de 20 mesh acoplada a uma de 60 mesh, para a recuperação das fêmeas do nematóide. A suspensão de fêmeas é transferida para copo do tipo americano e, na seqüência, são quantificadas com o auxílio de placa de acrílico quadriculada e microscópio estereoscópico. Para cada cultivar é calculado um índice de fêmeas (IF), isto é, IF (%)= (número médio de fêmeas obtido na cultivar em teste/número médio de fêmeas obtido em ‘Lee 74’) x 100. Cultivares com IF<10% são classificadas como resistentes, entre 10% e 30% como moderadamente resistentes e com IF>30% como suscetíveis.
Referências Bibliográficas:

RIGGS, R.D & SCHMITT, D.P.1988. Complete charaterization of the race scheme for Heterodera glycines. Journal of Nematology, 20:392-395.

SCHMITT, D.P. & SHANNON, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science, 32:275-277, 1992.

Característica 35. Reação à podridão parda da haste (Cadophora gregata, sin. Phialophora gregata)


Leila Maria Costamilan

Embrapa Trigo, Passo Fundo, RS


Os testes devem ser realizados em campo, em solo com infestação natural de C. gregata. As cultivares são semeadas em parcelas experimentais formadas por duas fileiras de 2,20 m, espaçadas 0,50 m, com 100 sementes cada, e com duas repetições. A cada 50 cultivares, são repetidas testemunhas suscetíveis de ciclos precoce, médio e tardio (exemplos: BRS 242 RR, BRS 245 RR e BRS 247 RR, respectivamente).

As avaliações visuais de percentual de plantas com sintomas foliares da doença (clorose e necrose internerval) são realizadas diretamente no campo, durante os estádios de desenvolvimento R5 (enchimento de grãos) a R6 (granação de 100% e folhas verdes).

Certificar-se de que não há interferência de outras doenças radiculares (ex.: podridão vermelha da raiz, nematóides, dentre outros) na expressão de clorose e necrose internerval.

Para caracterização da reação, usa-se a seguinte escala, baseada na percentagem de plantas com sintomas foliares (psf): resistente (R) = de 0 a 5% de psf; moderadamente resistente (MR) = 6 a 25% de psf; e suscetível (S) = acima de 25% de psf.



Referências Bibliográficas:

BONATO, E.R.; COSTAMILAN, L.M. ; BERTAGNOLLI, P.F. Avaliação da metodologia para seleção em campo de genótipos de soja resistentes à podridão parda da haste. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 24, n. 4, p. 561-563, 1999.







Figura 1. Plantas de soja com sintomas foliares (clorose e necrose internerval) de podridão parda da haste (Cadophora gregata)

Figura 2. Escurecimento interno (necrose) da medula e sistema vascular de haste de soja afetada por podridão parda da haste (Cadophora gregata)


Característica 36. Reação à mancha alvo (Corynespora cassiicola)


José Tadashi Yorinori

Tropical Melhoramento e Genética -TMG, Cambé, PR

As metodologias de inoculação, avaliação e critério de discriminação das reações são as mesmas descritas para mancha “olho-de-rã”. Deve-se anotar também a extensão (largura) do halo amarelo formado ao redor da lesão necrótica castanha ou castanho-avermelhada. Lesões com halo amarelo restrito (r) indicam maior tolerância, enquanto que halos grandes (g) indicam maior suscetibilidade. As avaliações de reações para mancha alvo podem ser feitas com inoculações em casa de vegetação e a campo sob infecções naturais, adotando-se os mesmos critérios de leitura de severidade (% a.f.i.), utilizadas para mancha “olho-de-rã”, acrescida dos tipos de halos formados ao redor dos pontos necróticos: halo restrito (r) ou halo “grande” (g). Cultivares moderadamente resistentes poderão ter grande número de lesões no terço inferior da folhagem, porém, a progressão da doença será mais lenta, pela falta de esporulação (inóculo secundário) e ausência de lesões nas hastes, vagens e pecíolos.

Descritores para definição de reação a mancha alvo


Reação

Severidade (% a.f.i.)

Observação

R = Altamente Resistente

NI= 0 a 2 (0 a 25% a.f.i.)

Halo (r) ou (g) com necrose restrita; sem infecção nas vagens

MR= Moderadamente resistente

NI= 3 (26% a 50% a.f.i.)

Sem infecção nas vagens

S = Suscetível

NI = 4 a 5 (acima de 51% a.f.i.)

Halos (r) ou (g), lesões grandes e infeccões nas hastes, pecíolos e vagens.

É possível distinguir as cultivares nas três categorias de reação pelo nível de severidade ou extensão dos halos (g ou r), e pela ausência ou severidade de lesões nas vagens, hastes e pecíolos.



As cultivares suscetíveis, além de apresentarem maior severidade de manchas com necrose no centro, apresentam lesões nas vagens, hastes e pecíolos. As cultivares altamente resistentes apresentam apenas sintomas nas folhas, com lesões menores, halos e necroses restritas.







Figura 1. Cultivar altamente resistente (TMG 106 RR), com halo e necrose restritos







Figura 2. Lesões em cultivar moderadamente resistente à mancha alvo, com halo grande, com necrose das manchas pouco desenvolvidas




Figura 3. TMG 121 RR, suscetível à mancha alvo






Figura 4. Sintoma em cultivar suscetível

Figura 5. Diferença de reação de cultivares com manchas em fase inicial de desenvolvimento: lesões escuras com halo restrito: cv. FT-Abyara, moderadamente resistente (esq.) e lesões com halo amarelo grande em FT-Estrela, suscetível








Figuras 6 A e B. Lesões em cultivar suscetível (TMG 103 RR)






Figuras 7 A e B. Folhas e vagens severamente infectadas da cv. TMG 108 RR, suscetível




Figura 8. Dano severo por mancha em cultivar altamente suscetível


Característica 37. Reação à podridão radicular de fitóftora (Phytophthora sojae)

Leila Maria Costamilan

Embrapa Trigo, Passo Fundo, RS
No teste de resistência completa o inóculo é preparado de forma semelhante ao teste do cancro da haste, inoculado com pontas de palito, cultivando-se o micélio por 10 dias em meio de cultura V8 - ágar. Espetar a ponta do palito colonizado em plantas de 10 a 15 dias após semeadura. Manter umidade saturada por 48 horas. A leitura ocorre 5 a 7 dias após inoculação, adotando-se a mesma metodologia de avaliação do cancro da haste.

São consideradas resistentes as cultivares que apresentarem até 30% de plantas mortas, moderadamente resistentes as cultivares com até 70% de plantas mortas, e suscetíveis, acima de 70% de plantas mortas (exemplos de cultivares suscetíveis: BRS 268, CD 202; exemplos de cultivares resistentes: BRS 243RR, CD 219RR).


Referências bibliográficas:

Schmitthenner, A.F.; Bhat, R.G. Useful methods for studying Phytophthora in the laboratory. OARDC Special Circular 143. Ohio State University, Department of Plant Pathology, Wooster. 1994.10p.






Figura 1. Cultivar de soja suscetível (à esquerda) e resistente (à direita) após inoculação

Figura 2. Detalhe do sintoma de suscetibilidade a Phytophthora sojae





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