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NESTA SEÇÃO
Boletim nº 021/10
Resp.: Jair Calixto

Fone: (11) 3897-9765



e-mail: jaircalixto@ sindusfarma.org.br


Consulta Pública nº 60, de 22 de junho de 2010.

D.O.U de 23/06/2010
A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso das atribuições que lhe confere o inciso IV do art. 11 e o art. 35 do Regulamento da ANVISA aprovado pelo Decreto nº 3.029, de 16 de abril de 1999, e tendo em vista o disposto no inciso V e nos §§ 1º e 3º do art. 54 do Regimento Interno aprovado nos termos do Anexo I da Portaria nº 354 da ANVISA, de 11 de agosto de 2006, republicada no DOU de 21 de agosto de 2006, em reunião realizada em 15 de junho de 2010, considerando que é responsabilidade da ANVISA a atualização e revisão periódica da Farmacopéia Brasileira;
considerando o Processo de Revisão de Monografias da Farmacopéia Brasileira e o desenvolvimento e revisão de métodos gerais da Farmacopéia Brasileira por instituições de ensino superior;
considerando que devem ser observadas as especificações de qualidade determinadas pela Farmacopéia Brasileira, para fins de controle de qualidade, registro e análises fiscais de produtos sujeitos ao regime de vigilância sanitária;
Adota a seguinte Consulta Pública e eu, Diretor-Presidente Substituto, determino a sua publicação:
Art. 1º Fica aberto, a contar da data de publicação desta Consulta Pública, o prazo de 30 (trinta) dias para que sejam apresentadas sugestões quanto às propostas de revisão e atualização dos Métodos Gerais da Farmacopéia Brasileira, além da inclusão de novos métodos descritos no Anexo desta Consulta.
Art. 2º Informar que os métodos gerais descritos no Anexo, estarão disponíveis, na íntegra, durante o período de consulta no endereço eletrônico www.anvisa.gov.br, e as sugestões com a justificativa e a identificação do método deverão ser encaminhadas por escrito para o seguinte endereço: Agência Nacional de Vigilância Sanitária/DIMCB/Farmacopéia Brasileira, SAI trecho 5 área especial nº 57, Bloco “E”, 1º Andar, Sala 4, Brasília/DF, CEP 71.205.050, ou Fax: (061) 3462-6791 ou e-mail: cp60.farmacopéia@anvisa.gov.br.
Art. 3º Findo o prazo estipulado no Art. 1º, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária submeterá à Comissão da Farmacopéia Brasileira as contribuições enviadas, para avaliação e os encaminhamentos devidos.
DIRCEU BRÁS APARECIDO BARBANO

ANEXO Métodos Gerais da Farmacopéia Brasileira
1. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-COMPLEMENTAR DA IMUNOGLOBULINA

2. DETERMINAÇÃO DA ANTITROMBINA III

3. DETERMINAÇÃO DA FUNÇÃO FC DA IMUNOGLOBULINA

4. DETERMINAÇÃO DA IMUNOGLOBULINA ANTI-D

5. DETERMINAÇÃO DO ATIVADOR DA PRÉ-CALICREÍNA

6. DOSEAMENTO DE PROTEÍNAS TOTAIS

7. ELETROFORESE

8. MATERIAIS E RECIPIENTES PARA MEDICAMENTOS E CORRELATOS

9. SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS DE REFERÊNCIA (SQR)
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOMPLEMENTAR DA IMUNOGLOBULINA
A determinação da atividade anti-complementar (AAC) da imunoglobulina é realizada por incubação de uma amostra de imunoglobulina (10 mg) com uma determinada quantidade de complemento de cobaia (20 CH50). Segue-se a titulação do complemento restante: a atividade anti-complementar é expressa pela proporção do complemento consumido, tomando o complemento padrão como 100 %.
A unidade hemolítica de atividade complementar (CH50) é a quantidade de complemento que, nas estipuladas condições de reação, provoca a lise de 2,5 X 108 de um número total de 5 X 108 hemácias devidamente sensibilizadas Solução mãe de magnésio e de cálcio. Dissolver 1,103 g de cloreto de cálcio e 5,083 g de cloreto de magnésio em água e completar 25 ml com o mesmo solvente.
Solução mãe de tampão de barbital. Dissolver 207,5 g de cloreto de sódio e 25,48 g de barbital sódico em 4.000 ml de água e ajustar o pH para 7,3 com ácido clorídrico 1 M. Adicionar 12,5 ml de solução mãe de magnésio e de cálcio e completar 5.000 ml com água. Filtrar por membrana (0,22 μ) e conservar a 4°C em recipiente de vidro.
Solução de gelatina. Dissolver 12,5 g de gelatina em cerca de 800 ml de água e aquecer a ebulição em banho de água. Resfriar até 20°C e completar 10 litros com água. Filtrar por membrana (0,22 μ) e conservar a 4°C. Utilizar unicamente uma solução límpida.
Solução citratada. Dissolver 8,0 g de citrato de sódio, 4,2 g de cloreto de sódio e 20,5 g de glicose em 750 ml de água. Ajustar a pH 6,1 com solução a 100 g/l de ácido cítrico e completar 1.000 ml com água.
Solução tampão de gelatina-barbital. Juntar 4 volumes de solução de gelatina a 1 volume de solução mãe de tampão barbital e misturar. Se necessário, ajustar o pH para 7,3 com ácido clorídrico 1 M ou hidróxido de sódio 1 M e conservar a 4°C. Preparar diariamente uma nova solução.
Sangue de carneiro estabilizado. Recolher 1 volume de sangue de carneiro em 1 volume de solução citratada e misturar. Conservar o sangue estabilizado a 4°C durante, pelo menos, 7 dias e, no máximo, durante 28 dias. O sangue de carneiro ou os eritrócitos de carneiro estabilizados podem ser obtidos comercialmente por diversos fornecedores.
Hemolisina. Soro anti-hemácia de carneiro, preparada em coelho. Tais soros podem ser obtidos comercialmente por diversos fornecedores.

Complemento de cobaia. Misturar os soros obtidos a partir de, pelo menos, 10 cobaias. Separar o soro do sangue coagulado por centrifugação a uma temperatura cerca de 4 °C. Conservar o soro, em pequenas porções, a uma temperatura inferior a -70°C.
MÉTODO
Padronização da solução de hemácias de carneiro a 5 %. Separar as hemácias de carneiro por centrifugação de um volume apropriado de sangue de carneiro estabilizado; lavar as células, pelo menos 3 vezes, com a solução tampão gelatina-barbital e preparar uma suspensão a 5 % V/V na mesma solução tampão. Determinar a concentração celular pelo seguinte método: adicionar 0,2 ml da suspensão a 2,8 ml de água e centrifuguar o lisado durante 5 minutos a 1.000 g. A concentração celular é adequada se a absorbância (V.2.14) do sobrenadante, determinada em 541nm, for de 0,62 ± 0,01. Corrigir a concentração celular por adição de solução tampão de gelatina-barbital, de acordo com a fórmula:
Vf = Vi X A

0,62
Vf = volume final,

Vi = volume inicial,
A =absorbância determinada em 541 nm para a suspensão original.

Uma vez ajustada a concentração celular, a suspensão contém cerca de 1 X 109 células por mililitro.



Titulação de hemolisina

Preparar as diluições de hemolisina de acordo com a Tabela 1.


Tabela 1- Diluições de hemolisina

Juntar 1,0 ml da suspensão a 5 % de hemácias de carneiro em cada um dos tubos da série de diluições de hemolisina a partir da diluição a 1/75 e misturar. Incubar os tubos a 37°C durante 30 minutos.
Transferir 0,2 ml de cada mistura incubada de diluição de hemolisina para novos tubos e adicionar 1,10 ml de solução tampão de gelatina-barbital e 0,2 ml de uma diluição de complemento de cobaia (por exemplo, 1/150). Realizar estas manipulações em duplicata.
Preparar 3 tubos controle de células não hemolisadas transferindo para cada um deles 1,4 ml de solução tampão gelatina-barbital e 0,1 ml da suspensão de hemácias de carneiro a 5 %.
Preparar 3 tubos controle de células totalmente hemolisadas transferindo para cada um deles 1,4 ml de água e 0,1 ml da suspensão de eritrócitos de carneiro a 5 %.
Incubar todos os tubos a 37°C durante 60 minutos e centrifugar a 1.000 g durante 5 minutos. Determinar a absorbância (V.2.14) dos sobrenadantes em 541 nm e calcular a porcentagem de hemólise ocorrida em cada tubo, usando a fórmula:
Aa – A1 X 100

Ab – A1

Aa = absorbância dos tubos contendo a diluição de hemolisina,

Ab = absorbância média dos 3 tubos com hemólise total,

A1 = absorbância média dos 3 tubos controle sem hemólise.
Construir um gráfico contendo as porcentagens de hemólises no eixo das ordenadas e os inversos das diluições de hemolisina no eixo das abscissas. Determinar a diluição ótima de hemolisina a partir do gráfico, escolhendo uma diluição tal que um aumento da quantidade de hemolisina não produza uma variação apreciável no grau de hemólise. Esta diluição considera-se como contendo 1 unidade de hemólise mínima (1 UHM) em 1,0 ml. Para a preparação das hemácias de carneiro sensibilizadas, a diluição de hemolisina correspondente à hemólise ótima contém 2 UHM por mililitro.
A titulação de hemolisina só é válida se a porcentagem de hemólise total estiver compreendida entre 50 e 70%. Caso a porcentagem de hemólise total não possa ser determinada a partir da diluição utilizada, repetir a titulação utilizando uma solução de complemento mais ou menos diluída.
Preparação ótima de hemácias de carneiro sensibilizada (sistema hemolítico).
Preparar uma quantidade apropriada de hemolisina diluída contendo 2 UHM por mililitro e um volume igual de suspensão padronizada de eritrócitos de carneiro a 5%. Juntar a diluição de hemolisina à suspensão padronizada de células e misturar. Incubar a 37°C durante 15 minutos, conservar a temperatura de 2 a 8°C e utilizar dentro do período de 6 horas.
Titulação do complemento
Preparar uma diluição apropriada de complemento (por exemplo, 1: 250) utilizando a solução tampão de gelatina-barbital e realizar a titulação, em duplicata, de acordo com a Tabela 2.
A cada tubo, juntar 0,2 ml de eritrócitos de carneiro sensibilizados, misturar bem e incubar todos os tubos a 37°C durante 60 minutos. Resfriar os tubos em água com gelo e centrifugar a 1.000 g durante 5 minutos. Determinar a absorbância dos sobrenadantes em 541 nm e calcular o grau de hemólise (Y), usando a fórmula:
Ac – A1

Ac – A1


A c = absorbância dos tubos 1 a 12,

Ab = absorbância média dos tubos com 100 % de hemólise,

A1 = absorbância média dos tubos com 0 % de hemólise.
Tabela 2 – Diluição do complemento

Construir um gráfico inscrevendo os valores em abscissas, e o correspondente volume em mililitros de complemento diluído em ordenadas.


A partir dos pontos, traçar a reta ideal e determinar a ordenada da dose hemolítica a 50% do

complemento no ponto onde Y / ( 1 – Y) = 1,0. Calcular a atividade em termos de unidades hemolíticas (CH50/ml) de acordo com a fórmula:


Cd

Ca X 5

Cd = valor inverso da diluição de complemento,

Ca = volume em mililitros de complemento diluído que produz 50 % de hemólise,

5 = Fator de escala para ter em conta o número de eritrócitos.
O ensaio só é válido se, entre 15 e 85 % de hemólise, a curva obtida for uma reta cuja inclinação se situe entre 0,15 e 0,40, de preferência, entre 0,18 e 0,30.
Determinação de atividade anticomplementar
Diluir o complemento de cobaia titulada com a solução tampão de gelatina-barbital de modo a obter 100 CH50/ml. Se necessário, ajustar a amostra para pH 7. Para uma imunoglobulina contendo 50 mg/ml, preparar as seguintes misturas de incubação:

Realizar a determinação na amostra e preparar o controle da AAC negativo e positivo a partir de um padrão internacional de imunoglobulina humana, de acordo com as instruções fornecidas no rótulo que acompanha a preparação padrão.
Se a amostra não contiver 50 mg/ml de imunoglobulina, ajustar os volumes da preparação e da solução tampão de gelatina-barbital; por exemplo, tomar 0,33 ml de uma preparação que contem 30 mg/ml de imunoglobulina e adicionar 0,47 ml de solução tampão de gelatinabarbital de modo a obter o mesmo volume total de 0,8 ml.
Fechar os tubos e incubá-los a 37°C durante 60 minutos. Juntar 0,2 ml de cada mistura de incubação a 9,8 ml de solução tampão de gelatina-barbital para diluir o complemento. Em cada tubo, realizar as titulações do complemento tal como descrito acima para determinar a atividade anti-complementar residual (ver Tabela 2).
Calcular a atividade anti-complementar da amostra, por referência ao controle do complemento considerado como 100 %, de acordo com a fórmula:
a b X 100

a
a =atividade complementar média (CH50/ml) dos controles,

b =atividade complementar (CH50/ml) da amostra.
O ensaio só é válido se:
– as atividades anti-complementar encontradas para o controle AAC negativo e controle AAC positivo se situarem dentro dos limites indicados no rótulo que acompanha a preparação padrão;
– a atividade complementar do controle do complemento (a) for de 80 a 120 CH50/ml.
DETERMINAÇÃO DA ANTITROMBINA III HUMANA

O teor em antitrombina III da amostra é determinado comparando-se a sua capacidade de inativação da trombina em presença de um excesso de heparina com a capacidade de uma preparação padrão de concentrado de antitrombina III humana calibrada em Unidades Internacionais. Quantidades variáveis da amostra são adicionadas a uma trombina e a atividade trombínica residual é determinada com um substrato cromogênico apropriado.


A Unidade Internacional corresponde à atividade de uma quantidade determinada do Padrão Internacional de concentrado de antitrombina III humana. A equivalência Internacional e o Padrão Internacional são indicados pela Organização Mundial de Saúde.
Método.
Para a amostra e para o padrão preparar com solução tampão de tris-EDTA ASB de pH 8,4 contendo 15 U.I. de heparina por mililitro, 2 séries independentes de 3 ou 4 diluições compreendidas entre 1/75 e 1/200 a partir de 1 U.I./ml. Aquecer a 37°C durante 1 a 2 minutos 200 μl de cada diluição. Juntar a cada diluição 200 μl de uma solução de trombina bovina contendo 2 U.I./ml em solução tampão de tris-EDTA ASB de pH 8,4. Misturar e manter a 37°C durante exatamente 1 minuto. Juntar 500 μl de um substrato cromogênico apropriado (por exemplo, D-fenilalanil-L-pipecolil-L-arginina-4-nitroanilida;
Dissolver este substrato em água para obter uma solução contendo 4 mmol/l e diluir com solução tampão de tris-EDTA ASB de pH 8,4 sem albumina até uma concentração apropriada para o ensaio de titulação).
Determinar imediatamente a absorbância em 405 nm (V.2.14) por pelo menos 30 segundos. Calcular a variação da absorbância (ΔA/min). Pode-se utilizar igualmente uma titulação de ponto final parando a reação com ácido acético e determinando a absorbância em 405 nm. A variação da absorbância (ΔA/min) é inversamente proporcional à atividade da antitrombina III humana. Verificar a validade do ensaio e calcular a atividade da amostra pelos procedimentos estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos (VI).
SOLUÇÕES TAMPÃO
Solução tampão de tris-EDTA ASB de pH 8,4

Dissolver 6,1 g de tris(hidroximetil)aminometano, 2,8 g de Iodeto de sódio, 10,2 g de cloreto de sódio e 10 g de albumina bovina em água, ajustar o pH (V.2.19) com ácido clorídrico 1 M e completar a 1 000 ml com água.


DETERMINAÇÃO DA FUNÇÃO Fc DA IMUNOGLOBULINA
Sangue humano estabilizado. Fazer uma flebotomia para coletar o sangue humano do grupo O em solução anticoagulante conservadora e preservadora do tipo ACD. Conservar o sangue humano estabilizado a 4°C, durante 3 semanas, no máximo.
Solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Dissolver 1,022 g de fosfato dissódico anidro, 0,336 g de fosfato monosódico anidro e 8,766 g de cloreto de sódio em 800 ml de água e completar 1.000 ml com o mesmo diluente.
Solução mãe de magnésio e de cálcio. Dissolver 1,103 g de cloreto de cálcio e 5,083 g de cloreto de magnésio em água e completar 25 ml com o mesmo diluente.
Solução mãe de tampão de barbital. Dissolver 207,5 g de cloreto de sódio e 25,48 g de barbital

sódico em 4.000 ml de água e ajustar para pH 7,3 com ácido clorídrico 1M. Juntar 12,5 ml da solução mãe de magnésio e de cálcio e completar 5.000 ml com água. Filtrar por membrana (0,22 μ) e conservar a 4°C em recipiente de vidro.


Solução tampão de albumina-barbital. Dissolver 0,150 g de albumina bovina em 20 ml de solução mãe de tampão de barbital e completar 100 ml com água.
Solução de ácido tânico. Dissolver 10 mg de ácido tânico em 100 ml de solução salina tamponada de fosfato de pH 7.2. Preparar imediatamente antes do uso.
Complemento de cobaia. Misturar os soros obtidos a partir de, pelo menos, 10 cobaias. Separar o soro do sangue coagulado por centrifugação a uma temperatura de aproximadamente de 4°C. Conservar o soro, em pequenas porções, a uma temperatura inferior a -70°C. Imediatamente antes de se iniciar a hemólise por ação do complemento, diluir para 125-200 CH50 por mililitro com solução tampão de albuminabarbital e, durante o ensaio, manter a solução diluída num banho de gelo.
Antígeno da rubéola. Antígeno de rubéola apropriado para as titulações da inibição de hemaglutinação. Título > 256 unidades HA. Tratamento dos eritrócitos humanos com ácido tânico. Separar os eritrócitos por centrifugação de um volume apropriado de sangue humano estabilizado.
Lavar os eritrócitos, pelo menos três vezes, com solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2 e depois suspender a 2 % V/V em solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Tomar 0,1 ml da solução de ácido tânico e completar 7,5 ml com solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2 (concentração final 1,3 mg/l);
misturar 1 volume da diluição recentemente preparada com l volume da suspensão de eritrócitos e incubar a 37°C durante 10 minutos. Recolher os eritrócitos tratados com ácido tânico por centrifugação (400-800 g, durante 10 minutos), rejeitar o sobrenadante e lavar os eritrócitos uma vez com solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Suspender a 1% V/V os eritrócitos tratados com ácido tânico na solução salina tamponada de fosfato de pH 7,2.
Adição dos antígenos aos eritrócitos. Tomar um volume apropriado (Vs) de eritrócitos tratados com ácido tânico, junte 0,2 ml de antígeno da rubéola por 1,0 ml de eritrócitos e incubar a 37°C durante 30 minutos. Recolher os eritrócitos por centrifugação (400-800 g, durante 10 minutos) e rejeitar o sobrenadante, deixando um volume de 200 μl. Juntar um volume de solução tampão de albumina-barbital igual ao volume do sobrenadante rejeitado, agitar até suspensão dos eritrócitos, recolher estes como acima descritos e repitir a lavagem. Completar o volume remanescente obtido de 200 μl até três-quartos de Vs , obtendo assim o volume inicial (Vi).
Misturar 900 μl de solução tampão de albumina-barbital com 100 μl de Vi, que é assim reduzido ao volume residual e determinar a absorbância inicial em 541 nm (A). Diluir Vr por um fator igual a A utilizando solução tampão de albumina-barbital. Obtém-se, assim, o volume final ajustado Vf = Vr X A de eritrócitos humanos sensibilizados e um valor para A de 1,0 ± 0,1 no caso de uma diluição a 1/10.
Ligação dos anticorpos aos eritrócitos com ácido tânico e cobertos de antígeno. Preparar, em duplicata e sucessivamente, as seguintes soluções utilizando para cada solução, em separado, uma cubeta semi-micro (por exemplo, placas descartáveis) ou um tubo de ensaio para cada solução:

(1) Soluções problema. Se necessário, ajustar a amostra a pH 7 adicionando, por exemplo, hidróxido de sódio 1 M. Tomar volumes da amostra contendo, respectivamente, 30 e 40 mg de imunoglobulina e completar 900 μl com solução tampão de albumina-barbital.


(2) Soluções padrão. Preparar a solução tal como se descreve para a solução problema a partir de um padrão de referência para imunoglobulina humana.
(3) Testemunho do Complemento. 900 μl de solução tampão de albumina-barbital. A cada cubeta/tubo de ensaio juntar 100 μl de eritrócitos humanos sensibilizados e misturar cuidadosamente.
Deixar em repouso durante 15 minutos, juntar 1.000 μl de solução tampão de albumina-barbital, recolher os eritrócitos por centrifugação (1.000 g durante 10 minutos) da cubeta/tubo de ensaio e retirar 1.900 μl do sobrenadante. Substituir este volume com 1.900 μl de solução tampão de albumina-barbital e repetir o procedimento da lavagem deixando um volume final de 200 μl. As amostras podem ser conservadas em cubetas/tubos de ensaio fechados a 4°C durante 24 horas.
Hemólise por ação do complemento. Para a determinação da hemólise adicionar 600 μl de solução tampão de albumina-barbital aquecida a 37°C à amostra, suspender cuidadosamente os eritrócitos pipetando-os repetidamente (pelo menos 5 vezes) e colocar a cubeta no porta-amostra de um espectrofotômetro com termostato. Após 2 minutos, juntar 200 μl de complemento de cobaia diluído para 125-200 CH50/ml, misturar cuidadosamente pipetando a mistura 2 vezes e inicie imediatamente após a segunda pipetagem o registro da absorbância em 541 nm em função do tempo, utilizando a solução tampão de albumina-barbital como líquido de compensação. Parar o registro se a curva da absorbância em função

do tempo ultrapassar nitidamente o ponto de inflexão.


Doseamento. Determinar o declive (S) da curva de hemólise no ponto aproximado da inflexão segmentando a curva na região de maior declive por intervalos de tempo apropriados (por exemplo, Δt = 1 minuto) e calculando S, expresso em ΔA por minuto entre os pontos de intersecção adjacentes. O valor mais elevado de S corresponde a (Sexp). Determinar também a absorbância no início da curva (As) por extrapolação da curva, a qual é quase sempre linear e paralela ao eixo do tempo nos primeiros minutos do registro. Corrigir Sexp de acordo com a fórmula:
S’= Sexp

AS
Para cada preparação, calcular a média aritmética dos valores de S’. Calcular o índice da função Fc

(IFc) a partir da fórmula:



I Fc = 100 X (S’ – S’c)

S’s – S’c

S’ = média aritmética do declive corrigido para a amostra;

S’s = média aritmética do declive corrigida para o padrão;

S’c = média aritmética do declive corrigida para o testemunho do complemento.

Calcular o índice da função Fc para a amostra. O valor não é inferior ao indicado pelo fabricante do padrão.


REAGENTES E SOLUÇÕES REAGENTES

Ácido tânico

Fórmula e massa molecular - C76H52O46 - 1701.

Descrição - Mistura de ésteres do ácido digálhico e da D(+)glicose, dos quais o mais importante é o éster pentadigálhicoglicose .

Características - pó amorfo ou lamelas brilhantes, amareladas ou castanhas claras.

Solubilidade- muito solúvel na água, facilmente solúvel no álcool, solúvel na acetona, praticamente insolúvel no éter.

Conservação: ao abrigo da luz.
Barbital sódico

Fórmula e massa molecular – C8H11N2NaO3 -206,2.

Descrição - Derivado sódico do 5,5-dietil-1H,3H,5H-pirimidin-2,4,6-triona.

Teor: no mínimo, 98,0 %.

Características - pó cristalino branco ou cristais incolores.

Solubilidade-facilmente solúvel na água, pouco solúvel no álcool, praticamente insolúvel no éter.

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