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NIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Departamento de Ciências dos Alimentos

Bacharelado em Química de Alimentos

Disciplina de Seminários





Métodos rápidos de análise microbiológica

Júlia Coswig Goldbeck

Pelotas, 2008.

Júlia Coswig Goldbeck



Métodos rápidos de análise microbiológica
Trabalho acadêmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Química de Alimentos da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial da disciplina de seminários.

Orientadora: Josiane Chim

Co-Orientadora: Carla Mendonça

Pelotas, 2008.




Agradecimentos
À colaboração de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andréia Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientação, confiança e oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
À Profa. Dra. Miriam Galvão e Dra. Caroline Borges, pela orientação e conhecimentos transmitidos.
Às orientadoras da referente disciplina, Profa. Dra. Carla Mendonça e Profa. Josiane Chim.
Aos amigos, e ao apoio e compreensão do meu companheiro de todas as horas, Wilson Colvara.
Ao órgão apoiador de minha graduação, CNPQ, pela concessão de bolsa Iniciação Científica.

“ A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e pensar no que ninguém pensou. "


( Jonathan Swift )

GOLDBECK, Júlia C. Métodos rápidos de análise microbiológica. 2008. 32f. Trabalho acadêmico. Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas.


Resumo
A necessidade de rapidez dos resultados de análise, fez surgir os métodos rápidos de análise microbiológica. Os métodos rápidos possuem várias vantagens, como diminuição de custos para a empresa, facilidade de leitura e interpretação dos resultados, bem como, simplificação de tarefas. Alguns desses métodos já são aprovados pela AOAC, porém, resultados positivos devem ser apenas presuntivos, enquanto que resultados negativos são considerados confirmatórios. Sob visão geral, os métodos são projetados especificamente para identificar um grupo ou espécie bacteriana. Quase todos os métodos rápidos são projetados para identificar um único alvo, o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. Os testes são similares no formato e desempenho e possuem de 90 – 99% de exatidão quando comparados a métodos convencionais, sendo que os resultados são obtidos em alguns minutos, segundos ou em algumas horas. Os métodos rápidos são divididos em métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade.

L

ista de tabelas




Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos encontrados no mercado..................................................................................

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Lista de figuras

Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos e conseqüente formação de colônias...........................................................................

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Figura 2 – Placas PetrifilmTM prontas para uso.........................................................

Figura 3 – Reação antígeno anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.............................

Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose................................................................


18

26

28



Figura 5 – Bax® System, sistema automatizado de PCR real time...........................

28

Figura 6 – Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada...........................................................

29




Sumário


1 Introdução...................................................................................................

10

2 Métodos rápidos........................................................................................

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2.1 Métodos convencionais x métodos rápidos........................................

13

3 Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos...................

15

3.1 Métodos para avaliar a qualidade.........................................................

15

3.1.1 Métodos de contagem direta..............................................................

15

3.1.1.1 Técnica de membrana filtrante........................................................

15

3.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta.................................................

16

3.1.1.3 Técnica fluorogênica........................................................................

17

3.1.1.4 Sistemas prontos para uso..............................................................

18

3.1.2 Métodos de contagem indireta...........................................................

19

3.1.2.1 Bioluminescência.............................................................................

20

3.1.2.2 Impedância/condutância..................................................................

21

3.1.2.3 Placas SIMPLATETM.........................................................................

21

3.2 Métodos para avaliar a inocuidade.......................................................

22

3.2.1 Métodos bioquímicos..........................................................................

22

3.2.2 Métodos imunológicos........................................................................

22

3.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos..............................................................

22

3.2.2.2 Imunocaptura....................................................................................

23

3.2.2.3 Imunoimobilização............................................................................

24

3.2.2.4 Coaglutinação...................................................................................

24

3.2.2.5 ELISA................................................................................................

24

3.2.3 Métodos moleculares..........................................................................

26

3.2.3.1 Sondas genéticas............................................................................

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3.2.3.2 Reação de Polimerase em cadeia (PCR)........................................

26

3.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado...............................................

2

8


3.2.3.4 Ribotipagem......................................................................................

2

8


4 Conclusões ................................................................................................

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Referências....................................................................................................

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  1. Introdução

É impossível determinar exatamente quando, na história da humanidade, o homem tomou conhecimento da existência de microrganismos e da sua importância para os alimentos.

Após o período no qual o ser humano tinha a sua alimentação baseada apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar animais e produzir o seu próprio alimento. Com o surgimento de alimentos preparados, começaram a ocorrer os problemas relacionados com doenças transmitidas pelos alimentos e com a rápida deterioração dos mesmos, principalmente pela conservação inadequada (FRANCO, 1999).

Entre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um produto, os mais importantes são, sem dúvida, aqueles que diferem as suas características microbiológicas. A avaliação microbiológica do alimento fornece informações que permitem avaliá-lo quanto às condições em relação à saúde da população.

Para que a análise microbiológica seja conduzida de forma que os resultados obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, é necessário que os critérios de avaliação sejam claramente estabelecidos. Esses critérios são definidos de modo a permitir uma avaliação segura e válida.

Os critérios de avaliação são estabelecidos pela legislação de cada país, e em nível internacional, por um programa conjunto FAO/WHO, da Organização das Nações Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e através da comissão do Codex Alimentarius.

No Brasil, padrões microbiológicos para alimentos são definidos em nível federal, pelo Ministério da Saúde sob RDC n° 12 de 02 de janeiro de 2001, devem ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Em nível estadual, alguns estados de federação, como São Paulo, têm legislação própria.

Logo, a análise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos estão presentes é fundamental, não somente para conhecer as condições de higiene de determinado produto, como também é para observar se os padrões e especificações microbiológicos, nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos adequadamente (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

Atualmente, a análise microbiológica de um alimento pode ser realizada através dos métodos “convencionais”, aqueles desenvolvidos há muitos anos e que ainda vêm sendo empregados como métodos oficiais, ou métodos rápidos, ao quais vêm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade.

Portanto, o objetivo do presente trabalho, foi conhecer as características, bem como as vantagens e desvantagens, em relação aos métodos convencionais, de alguns métodos rápidos empregados na análise microbiológica de alimentos.




  1. Métodos rápidos

Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70, como conseqüência da necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados analíticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (Hajdenwurcel, 1998).

São utilizados, geralmente, como técnicas de seleção e a fim de garantir a segurança dos consumidores. Sob visão geral, a maioria desses métodos consiste em um dispositivo descartável que contém 15 a 30 meios ou carcaças, projetados especificamente para identificar um grupo ou uma espécie bacteriana. Os testes são similares no formato e no desempenho e possuem exatidão de 90 – 99% quando comparados a métodos convencionais (Fung et al., 2000)

A maioria dos testes são projetados para identificar/quantificar as bactérias entéricas, como também Campylobacter, Listeria, bactérias anaeróbias, gran negativas e gran positivas. Os métodos rápidos mais encontrados no mercado são os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de bolores e leveduras, detecção de Salmonella spp. e Listeria, monocytogenes (Hajdenwurcel, 1998).

Quase todos os métodos rápidos são projetados para detectar um único alvo, o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar rapidamente um grande número de amostras contaminadas por um determinado patógeno (Yuste, 2007).

Os resultados com a utilização dos métodos rápidos podem se dar em alguns minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliações dos mesmos, mostram que o bom desempenho desses métodos está relacionado com o tipo de alimento. Isto pode ser atribuído, na maioria das vezes devido à composição química do alimento, por isso, é aconselhável executar estudos comparativos para assegurar a eficiência da análise (Fraqueza, 2002).

Ainda são poucos os métodos validados oficialmente para alimentos, porém, vários métodos alternativos de contagem têm sido proposto nos últimos anos, tem se observado que a área de métodos rápidos desenvolve-se de forma espantosa. Porém, muitos dos chamados “novos métodos em microbiologia de alimentos” nada tem de “novos”, são na verdade resultados da transposição de métodos há muito tempo utilizados em outras áreas da microbiologia.
2.1 Métodos convencionais X métodos rápidos
Os métodos convencionais recebem essa denominação porque foram desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados como métodos oficiais na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos. Esses métodos estão descritos em publicações consideradas de referência, internacionalmente aceitos e recomendados pela American Public Health Association (APHA), pelo International Commission on Microbiological Specification for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA).

O método convencional de contagem de microrganismos consiste basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto homogeneizado e de suas diluições em meios de cultura sólidos, adequadamente selecionados em função do microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis (semeadura em superfície), ou então o meio de cultura pode ser adicionado após a transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em profundidade). As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e temperatura adequada para a determinação a ser feita, durante a qual os microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis, que podem ser enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos (Franco, 1999).

Apesar da aparente simplicidade dessa técnica, ela é bastante trabalhosa e sujeita a erros, levando em consideração que: os microrganismos estão arranjados em pares, tétrades, cadeias e cachos, conseqüentemente, o número de colônias que aparece na placa não corresponde ao número de células individuais presentes, além disso, quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver erros, bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias, levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difícil, pois pode variar de acordo com o analista, além de ser cansativa e imprecisa, mesmo quando contadores automáticos são empregados (Silveira et al.,1997).

Visando minimizar estes problemas, surgiram os métodos alternativos (métodos rápidos), que apresentam a conveniência de produzirem resultados mais rápidos, sensíveis e específicos, se comparados às técnicas convencionais. Tais métodos também podem oferecer economia de espaço e materiais, aumentando a produtividade laboratorial. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de análises microbiológicas, em face do alto volume de alimentos à disposição do consumidor em curto espaço de tempo (SILVA, 1996).

Como vantagens dos métodos rápidos, pode-se enumerar:


  • Redução do tempo de análise;

  • Menor tempo de retenção do produto na indústria;

  • Diminuição de custos;

  • Simplificação das tarefas envolvidos na análise;

  • Facilidade de leitura dos resultados;

  • Especificidade;

  • Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os métodos convencionais.

Contudo, ao se escolher e implantar os métodos rápidos deve se levar em conta parâmetros como precisão, custo, tempo de análise, aceitabilidade pelos órgãos oficiais, simplicidade de operação, assistência técnica dos fabricantes e disponibilidade de espaço no laboratório. Porém, segundo Feng (1995), os métodos rápidos aprovados pelos órgãos oficiais podem ser utilizados somente para controle, sendo que os resultados negativos são considerados como definitivos, mas resultados positivos são considerados presuntivos e devem ser confirmados por métodos padrões.


3. Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos
Os métodos rápidos podem ser divididos em dois grupos: métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA, 2006). Os métodos que avaliam a qualidade do alimento estão mais relacionados aos microrganismos deteriorantes, aqueles não patogênicos, já os métodos que avaliam a inocuidade, quantificam/identificam microrganismos patogênicos.
3.1 Métodos para avaliar a qualidade

3.1.1 Métodos de contagem direta

3.1.1.1 Técnica de membrana filtrante

Utilizada há bastante tempo para enumeração de coliformes totais, fecais e Escherichia coli em água, porém, seu uso em alimentos é mais recente. A mistura alimento-diluente é filtrada através de membranas filtrantes de acetato de celulose ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45µm) para retenção dos microrganismos presentes nessa mistura. Em seguida as membranas são transferidas para a superfície de placas contendo ágar ou cartões absorventes saturados com meio de cultura. Após o tempo de incubação adequado para cada microrganismo, faz-se a enumeração das colônias que surgiram na superfície das membranas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas quadriculadas e pelo uso de contadores automáticos.

A técnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens:


  • Remove os componentes do alimento que podem interferir no crescimento microbiano (sólidos em suspensão ou agentes antimicrobianos);

  • Microrganismos presentes em pequeno número, por vezes não detectáveis em outras técnicas, podem ser “concentrados” pela filtração de volume maior da amostra;

  • Permite a contagem de 1 até 1,6x10-3 UFC por membrana, o que elimina a necessidade de diluição;

  • As colônias são coradas para facilitar a visualização.

O uso de membranas Isogrid é aprovado pela AOAC para enumeração de bactérias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella, sendo também aprovados diversos tratamentos enzimáticos que podem ser utilizados em função do tipo de alimento, para melhorar a filtrabilidade.

Além da aprovação oficial, as membranas podem ser também utilizadas para a pesquisa de Staphylococcus aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocolítica, C. perfringens, P. aeruginosa, bactérias gran negativas e estreptococus fecais. Sua aplicação em alimentos como leite, carne, condimentos, farinhas vegetais, frutos do mar e outros têm apresentado ótimos resultados (MACHADO, 2007).


3.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta
Técnica rápida de contagem de microrganismos que não depende de seu cultivo e conseqüente formação de colônias. Os microrganismos viáveis e não viáveis são enumerados por microscopia, sendo uma das técnicas que oferece resultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com enzimas e tensoativos, se necessário, é filtrada através de uma membrana de policarbonato, que retém os microrganismos. Essa membrana é então corada com fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de fluorescência. O corante permite a diferenciação das células viáveis, pois o DNA e RNA corados apresentam fluorescência de coloração diferente, em função da fase de crescimento microbiano. As células viáveis apresentam fluorescência laranja-avermelhado, enquanto células mortas têm fluorescência verde. A epifluorescência direta tem boa sensibilidade, resultante da concentração das células na superfície da membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite.

Essa técnica, porém,apresenta algumas desvantagens:



  • Técnica muito cansativa;

  • Injúria de bactérias devido ao calor pode alterar a fluorescência;

  • O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes laboratórios (MACHADO, 2007).


3.1.1.3 Técnica fluorogênica
Os testes baseados na adição de MUG (4-metil-umbeliferil-β-D-glicuronideo) a um caldo de cultura para detecção de Escherichia coli., são exemplos desta técnica. A enzima β-glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse microrganismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado sob luz ultravioleta de onda longa. A observação do número de tubos turvos, com gás e fluorescentes após 24 ou 48h, permite o cálculo do número mais provável de E. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007).

Este método oferece como vantagens:

- Rapidez e facilidade de usar;

- Identificação direta e enumeração de Escherichia coli ou enterococos em 36 horas (em comparação com 3 ou 4 dias usando métodos tradicionais);

- Dispensa a preparação de meio de cultura;

- Emprega microplacas estéreis e prontas para uso;

- Padronização do preparo, incubação e técnica de leitura para E. coli e Enterococcus;

- Detecção da atividade de uma enzima específica de cada bactéria por microplaca;

- Resultados confiáveis;

- Economia de tempo e material.

A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscópio fluorogênico, usado nesta técnica para enumerar as células viáveis não viáveis.


Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos.

Fonte: Google imagens (Epifluorescência direta), 2008.

3.1.1.4 Sistemas prontos para uso

Existem diferentes sistemas disponíveis comercialmente, com princípios distintos, nos quais os meios de cultura já vêm prontos para uso, muitas vezes já na própria placa de petri. Entre esses, destacam-se as Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou fluorogênicos.

As placas PetrifilmTM são produzidas e comercializadas pela 3M, são filmes de papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados e géis hidrossolúveis a frio. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno, que na face voltada para o filme inferior é revestido por géis hidrossolúveis a frio e um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC), com exceção daquelas usadas para contagem de fungos.

As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8°C, antes do uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposição das mesmas a temperaturas superiores a 25°C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu desempenho.

As placas Petrifilm são prontas para uso, isto é, basta erguer o filme superior e inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posição inicial e aplicar um difusor plástico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, através de leve pressão manual. Os agentes gelificantes são solúveis em água e a frio. A água de diluição contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a hidratação dos nutrientes e a geleificação da mistura.

Após a geleificação (1 min) as placas são incubadas na temperatura e tempo adequados, fazendo-se em seguida a enumeração de colônias. As colônias apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo microrganismo passa de incolor para vermelho.

A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumeração de: bactérias aeróbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactérias, leveduras e bolores e ainda bactérias láticas.

Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos, necessário incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados, sendo a incubação pelo período de 3-5 dias a 25°C (Sant’ana; Conceição; Azeredo, 2002).

Entre as vantagens desse sistema, tem-se:


  • Ser um sistema pronto para uso;

  • Execução fácil e rápida, que dispensa a necessidade de preparo de meios de cultura, do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais;

  • Custo baixo;

  • Obtenção rápida dos resultados.

A Fig. 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno e, como é observado o resultado final, respectivamente,





Figura 2. Placas PetrifilmTM prontas para uso.

Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm), 2008.


3.1.2 Métodos de contagem indireta

Além das técnicas diretas os analistas têm a seu dispor diversas técnicas alternativas indiretas, baseadas na medição da atividade metabólica dos microrganismos nos alimentos. Nestas técnicas os microrganismos presentes são quantificados através da dosagem de determinados produtos metabólicos, que produzem quando se multiplicam nos alimentos ou, ainda, através de medidas de alterações físicas ocorridas durante este processo. Estas técnicas exigem a construção de curvas-padrão, nas quais se faz a correlação entre os parâmetros medidos e o número de células viáveis presentes. O princípio básico é quanto maior o número de microrganismos presentes mais intenso é o fenômeno medido, desta maneira quanto maior for o nível de contaminação de um produto, menor é o tempo de retenção.

Através destas técnicas, teoricamente, é possível detectar a presença de até uma célula viável na amostra em teste (Franco et al., 1992).
3.1.2.1 Bioluminescência
Esta técnica está baseada no princípio de que a quantidade de Adenosina Trifosfato (ATP) presente em um sistema está relacionada ao numero de células metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. Uma das formas mais simples de se medir a quantidade de ATP é através do sistema luciferina-luciferase, inicialmente obtido da cauda de vagalumes ou extraído de peixes e, mais recentemente, obtido por manipulação genética de microrganismos. ATP reage com a enzima luciferase, na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz.

A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um espectrofotômetro de cintilação líquida, podendo ser expressa através da seguinte reação:



Mg+2

E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP + PP
E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz
E = enzima luciferase, LH2 = luciferina , E - LH2 - AMP = complexo luciferase-luciferina-AMP

Equação 1. Reações que ocorrem durante o ensaio de bioluminescência.


Uma das grandes aplicações dessa técnica é o monitoramento da eficiência de procedimentos de limpeza e higienização em plantas processadoras de alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Esta técnica é bastante conveniente no monitoramento de programas de APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle).

Apresenta como vantagens:


  • Fácil leitura, com valores máximos e mínimos;

  • Resultados em minutos;

  • Sistema portátil, fácil transporte;

  • Fácil utilização, qualquer pessoa pode usar;

  • Capacidade de armazenamento de dados (memória);

  • Não necessita adição de soluções;

  • Medição exata da quantidade de ATP.


3.1.2.2 Impedância/Condutância
São baseadas na propriedade que os microrganismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. Essas alterações ocorrem como conseqüência da mudança da composição química desse meio devido à atividade metabólica dos microrganismos presentes. Durante a multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídeos, carboidratos) são transformadas em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos orgânicos), quimicamente mais ativas; o acúmulo desses metabólitos finais resulta em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio (SILVEIRA, 2006).

São exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMéurieux), RABIT (Don Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments).


3.1.2.3 Placas SIMPLATETM
Técnica alternativa para a enumeração de bactérias totais, coliformes, Escherichia coli, bolores e leveduras em alimentos. As placas são plásticas e apresentam 84 ou 198 câmaras, às quais se adicionam alíquotas da amostra em análise e o meio de cultura Simplate. As placas são incubadas a 35ºC por 24 horas. A contagem de bolores e leveduras e bactérias mesófilas são realizadas enumerando-se as câmaras que apresentam fluorescência sob luz UV. Coloração púrpura indica presença de coliformes totais e fluorescência sob luz UV presença de Escherichia coli. O número de microrganismos é determinado através de uma tabela, expressando-se o NMP.g-1 ou mL-1 de alimento analisado (Silva; Gallo, 2003).

3.2 Métodos para avaliar a inocuidade
3.2.1 Métodos Bioquímicos
São baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos. Existem no mercado diversos “kits”, na maioria miniaturizados, onde os testes são executados com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram na forma desidratada ou liofilizada, e são reidratados pela adição de pequeno volume da amostra a ser testada. Após a incubação faz-se a leitura dos resultados, normalmente através de uma combinação de números obtida de acordo com o resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. Cada combinação de números corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO, 2007).

3.2.2 Métodos Imunológicos
Esses métodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e, em função disso, vêm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de alimentos. São baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos, os quais podem ser poli ou monoclonais. Os principais métodos imunológicos são descritos abaixo (SILVEIRA, 2006).
3.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos
Nesses ensaios um dos reagentes, antígeno ou anticorpo, fica adsorvido a superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno, placas de microtitulação, partículas metálicas revestidas de policarbonato e outras). A reação é baseada na ligação não covalente e reversível do antígeno com o anticorpo específico, no qual um desses reagentes é marcado com uma enzima, normalmente cromogênica, ou seja, que age em reações que resultam no desenvolvimento de cor. A cor formada pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro. Dois tipos de ensaios imunoenzimáticos são mais comumente utilizados: competitivo e não competitivo. O tipo não competitivo, também conhecido como tipo Sanduíche, é o mais utilizado nos sistemas de triagem de microrganismos patogênicos em alimentos (SILVEIRA, 2006).

Existe no mercado um grande número de sistemas comerciais baseados em técnicas imunoenzimáticas, conforme a Tab. 1, a seguir.


Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos

encontrados no mercado


SISTEMA

FABRICANTE

Salmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck

Organon Teknika

Listeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureus-Via

Tecra

Unique Salmonella, Unique Listeria

Tecra

ECOLI

Difcro

Listeria Rapid Test

Oxoid

REVEAL Listeria, Salmonella e E. coli

Neogen

Vip E. coli

Biocontrol

VIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E. aureus

bioMéuriex
Fonte: MACHADO, 2007.
3.2.2.2 Imunocaptura
Também chamada de imunoseparação magnética, nessa técnica os anticorpos ficam ligados a partículas metálicas recobertas com policarbonato. Após a ligação com o antígeno específico, as partículas metálicas são atraídas por um imã, permitindo que o restante do material seja removido. Após a retirada do imã, obtém-se um produto concentrado que pode, então, ser submetido aos testes de escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa técnica, quando aplicada diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de pré-enriquecimento, sempre necessária quando se pretende investigar a presença de microrganismos patogênicos em alimentos por métodos convencionais (SILVA, 1996).


3.2.2.3 Imunoimobilização
Nessa técnica, bactérias móveis cultivadas em meio semi-sólido têm sua mobilidade bloqueada pela adição de anticorpos flagelares específicos. Há formação de uma banda de precipitação visível na interface anticorpo-bactéria.
3.2.2.4 Coaglutinação
Essa técnica é baseada na aglutinação de partículas de látex sensibilizadas com anticorpos antitoxinas. Também são conhecidas como reações de aglutinação de látex ou aglutinação passiva reversa.
3.2.2.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos específicos no soro. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças infecciosas uma vez que vários agentes patológicos induzem a produção de anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfócitos B do sistema imunológico humoral humano.

Este é o teste de primeira linha no diagnóstico da infecção pelo HIV vírus da SIDA/AIDS, estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato, no entanto, os testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos como um dos antígenos do HIV - a proteína p24 - fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.

Um resultado positivo num teste de ELISA é sempre confirmado por outros testes específicos como é o caso do Western blot, que detecta proteínas do vírus, e do PCR, que detecta os ácidos nucleicos virais.

O teste ELISA também pode ser utilizado de diversas outras formas. Utilizando-se de um método semelhante ao método de Imunoradioensaio, pode-se transformar muitas outras substâncias em antígeno e obter um anticorpo do mesmo. Assim, é possível utilizar o teste para se detectar outras substâncias de interesse como, por exemplo, hormônios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, o teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata.

O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-antígeno. Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde serão adsorvidas as proteínas de interesse. Depois é realizada uma lavagem com uma proteína inespecífica para que esta ocupe os poços livres. A superfície é então tratada com solução de anticorpo primário, sabendo-se que exista uma quantidade maior de anticorpo do que a proteína, específico para a proteína de interesse e este vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida o produto é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de interesse (Simersky,2000).

A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reação específica entre o antígeno e o anticorpo.

Figura 3. Reação antígeno e anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.

Fonte: Google Imagens (ELISA), 2008.

A figura acima, mostra como é possível estabelecer a concentração do analito em questão, ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima cromogênica, menor é a concentração do analito, uma vez que, a enzima cromogênica liga-se á enzima conjugada. A concentração é obtida através de uma curva de calibração (Absorbancia x concentração), sendo porém inversamente proporcional a quantidade do analito.
3.2.3 Métodos Moleculares
3.2.3.1 Sondas genéticas
Nessa técnica é necessário submeter os microrganismos a um tratamento em que seu material genético é liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida, adicionam-se sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA específicos para o patógeno alvo, marcadas com enzimas, normalmente cromogênicas e, quando há hibridização com a sonda, há desenvolvimento de cor e, portanto, a presença do microrganismo investigado é detectada (MACHADO, 2007).
3.2.3.2 Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
É uma técnica muito utilizada em microbiologia para amplificação do material genético de microrganismos.

            1. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizada com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações (FUNG, 2002).

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC, por pouco tempo, para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC, dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2ciclo. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida (figura 4).




            1. Figura 4. Eletroforese em gel de agarose.

Fonte: Google Imagens (PCR), 2008.
            1. Atualmente existem outras técnicas mais rápidas que a PCR, como por exemplo o Bax Sisten o qual é um sistema automatizado de PCR real-time, baseado em DNA para análises microbiológicas de Salmonella, E.Coli 0157:H7, Listeria Monocytogenes, Listeria.sp, Enterobacter.sakazakii, Campylobacter jejuni/coli, Bolores e Leveduras. Roda de uma a noventa e seis análises por vez, com resultados disponíveis em cerca de 3 horas e meia. Essa técnica avalia a característica genética da bactéria, o que aumenta a capacidade e a estabilidade do método de uma forma única, pois as variações do meio, flora acompanhante e outras variáveis têm as suas influências reduzidas a praticamente zero (YUSTE; FUNG, 2007).
                  1. A Fig. 5 mostra, ilustrativamente, a técnica acima citada, onde a leitura é feita diretamente na tela do aparelho, ou seja não há a necessidade de realizar uma eletroforese, como na técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR).


Figura 5. Bax® System, sistema automatizado de PCR real time

Fonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem), 2008.


3.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado
Esses bacteriófagos carregam informação genética para a síntese de proteínas especiais, responsáveis pela formação de cristais de gelo, quando a amostra é resfriada adequadamente. Esse princípio é utilizado em um teste para Salmonella e, quando esse microrganismo está presente na amostra, os bacteriófagos se ligam a Salmonella e o material genético é introduzido na bactéria, que passa a sintetizar proteínas especiais. A formação dos cristais de gelo provoca alteração na coloração do meio, facilmente observada a olho nu (MACHADO, 2007).
3.2.3.4 Ribotipagem
É feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de espécie. Virtualmente qualquer bactéria pode ser identificada por esse método.
                  1. Como exemplo pode-se citar o Riboprinter® System da DuPont Qualicon é a única tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada, além de criar um banco de dados digital. O processo se baseia na ribotipagem, ou seja, na análise e comparação de DNA-RNA oferecendo assim, um alto poder discriminatório pela diferenciação em nível genético.
A Fig. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter® System da DuPont Qualicon.



Figura 6. Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada.

Fonte: Google imagens (Ribotipagem), 2008.

    Com este equipamento é possível realizar a rastreabilidade completa do microrganismo em questão, identificando a fonte e causa da contaminação  de uma maneira direta e indubitável, pois fornece um perfil genético de cada uma das bactérias implicadas, permitindo que as bactérias com o ribogrupo coincidente sejam identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al, 1996).





  1. Conclusões

A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurança da qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados á indústria alimentar. Logo, devido à necessidade de rapidez de resultados, hoje, já são encontrados no mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos, essas técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”, os mais usados na área da pesquisa são PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas simplate.

Os métodos rápidos possuem muitas vantagens, como boa exatidão, além de minimizar os custos de uma empresa, sendo de rápida e fácil leitura, porém, possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas técnicas e mesmo aqueles já aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda não são considerados confirmatórios.

No entanto, torna-se imprescindível, não só aos microbiologistas, mas a todos da área de alimentos, estarem interados com essas novas técnicas, pois estas vêm crescendo, substituindo, em parte, os métodos convencionais aplicados na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos.




Referências
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