Outros métodos de diagnóstico directo: detecção de toxinas; pesquisa de antigénios



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Microbiologia Médica 2006/2007

Aula Prática n.º 6

Outros métodos de diagnóstico directo: detecção de toxinas; pesquisa de antigénios;

biologia molecular.

Diagnóstico indirecto: vantagens e dificuldades.


PROCESSOS IMUNOLÓGICOS e Biologia Molecular





  • Compreender os conceitos diagnóstico directo e indirecto

  • Compreender os conceitos de antigénio e anticorpo

  • Compreender o conceito de anti-soro e descrever modos de produção

  • Descrever o conceito e procedimento geral para a identificação de antigénios/anticorpos

  • Compreender técnicas e procedimentos para detecção de microrganismos por biologia molecular.



Serologia
Texto de apoio:
Introdução
Considera-se diagnóstico directo aquele em que é pesquisado o organismo ou os seus determinantes antigénicos ou componentes estruturais (exs: exotoxinas, cápsula polissacarídica, ácidos nucleicos, etc), constituindo diagnóstico indirecto a verificação da resposta imunológica do hospedeiro.

No sentido estrito serologia refere-se à determinação de anticorpos no soro do doente, mas num sentido mais lato envolve a determinação quer de antigénios quer de anticorpos, tanto no soro como em outros produtos biológicos, quer até directamente nas culturas. As provas serológicas baseiam-se, na detecção de reacções antigénio-anticorpo.

Em relação à quantificação de anticorpos séricos para uma determinada substância (ou microrganismo) é dada sob a forma de título, que corresponde ao inverso da maior diluição para a qual a reacção ainda é positiva. O título determina-se efectuando diluições seriadas do soro em diferentes tubos (por exemplo a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 e assim sucessivamente), e fazendo-os a todos reagir com uma solução contendo o antigénio conhecido. Se, por exemplo, na diluição de 1/16 houve reacção (e em todas as anteriores) e já não houve na de 1/32, diz-se que o título é 16.

O significado clínico dum determinado título é controverso, dependendo do anticorpo em questão (e da sua relação ou não com doença), do estado imunológico do hospedeiro, do tipo de reacção efectuada e do método utilizado para a sua detecção.

Os vários laboratórios têm valores de referência ditos "normais" (conceito estatístico), a partir dos quais se considera a prova positiva. Pensa-se que, mais importante do que a constatação isolada de um título elevado, é uma subida do título de, pelo menos, quatro vezes entre duas determinações consecutivas e intervaladas.
Provas Serológicas
São muito diversificados os métodos de que actualmente dispomos para detectar as reacções antigénio-anticorpo, havendo ainda métodos não imunológicos com grande interesse em Microbiologia.

Pela sua importância, salientam-se as seguintes provas:

- precipitação; precipitação em gel (imunodifusão radial simples, imunodifusão dupla, imunoelectroforese, contra-imunoelectroforese, electroforese rocket);

- aglutinação (aglutinação de partículas de látex, hemaglutinação); co-aglutinação; floculação;

- fixação do complemento (em desuso);

- IF - imunofluorescência;

- ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay);

- RIA (radioimmunoassay)

- LAL (teste lisado de Limulus) (em desuso);

- neutralização; efeitos na actividade microbiana;

- immunoblotting

Precipitação
Trata-se de uma reacção em que o antigénio e o anticorpo são solúveis. A reacção de precipitação é indicada pela formação de um precipitado visível, quando as duas soluções se encontram. No entanto, a formação do precipitado pode ser inibida pelo excesso do anticorpo ou do antigénio. Este tipo de reacção pode ser usada para a determinação da proteína C reactiva.

A proteína C reactiva é uma proteína de fase aguda, que se encontra aumentada no soro do doente em várias patologias inflamatórias, de natureza infecciosa ou não, e que tem a particularidade de reagir com um ácido teicóico da parede celular do Streptococcus pneumoniae (substância C). Assim sendo, a sua pesquisa pode fazer-se adicionando ao soro problema essa substância (a partir de uma cultura de Streptococcus pneumoniae) ou, em alternativa, um anticorpo já preparado anti-proteína C reactiva, e observando se há ou não precipitação.

As reacções de precipitação são mais sensíveis e podem ser melhor observadas se o antigénio e o anticorpo difundirem um em direcção ao outro num gel de agar, o que constitui a base de diferentes métodos.

Na imunodifusão radial simples, colocam-se concentrações definidas de antigénio (ou anticorpo) em pequenos poços abertos numa placa de agar embebido no anticorpo respectivo (ou antigénio)formando-se um anel de precipitação cuja área pode ser determinada.

Na imunodifusão dupla, o gel de agar não possui antigénio ou anticorpo dissolvidos, estes são colocados em poços abertos na placa. Ambas as substâncias, ao difundirem, acabam por se encontrarem e reagirem, observando-se bandas de precipitação.

Na imunoelectroforese, podem colocar-se os antigénios em poços e o anticorpo ao longo de um sulco central no gel de agar, fazendo actuar sobre o conjunto um campo eléctrico, o que também dá origem a bandas de precipitação que podem ser estudadas.

A contra-imunoelectroforese é efectuada em gel em que o pH é escolhido de forma a que o anticorpo está carregado positivamente e antigénio negativamente. Aplica-se um campo eléctrico ao longo da placa, e forma-se um arco de precipitação. O princípio é semelhante ao da imunodifusão dupla, embora a sensibilidade seja 10 a 20 vezes superior.

Na electroforese-rocket, aplica-se um campo eléctrico a um gel que contém um anticorpo, ao longo do qual se vão deslocar os antigénios, que devem ter carga eléctrica diferente. Formam-se, assim, colunas de precipitação, de dimensões diferentes de acordo com a concentração.



Aglutinação
As reacções de aglutinação têm por base a adsorção de antigénios conhecidos a partículas grandes em suspensão (partículas de látex, bactérias, glóbulos rubros, etc.). Colocando essa suspensão em contacto com o soro do doente, verifica-se se este possui o anticorpo em questão, o que se traduz pela aglutinação das partículas, facilmente visível a olho nu.

São exemplos de reacções de aglutinação as reacções de Widal (para Salmonellae), de Wright (para Brucellae) e de Weil-Felix (para Rickettsiae). Nesta última não se usam antigénios de Rickettsiae pela dificuldade na sua obtenção, mas as estirpes OX-2, OX-19, OX-K de Proteus vulgaris, uma vez que se verificou que estas dão reacção cruzada com os anticorpos anti-Ricketsiae.

Para além dos agentes referidos, podem usar-se reacções de aglutinação no diagnóstico de diversas outras doenças, bem como na identificação de anticorpos contra parasitas (Plasmodium, Leishmania, Toxoplasma gondii).

A aglutinação de partículas de látex é eficaz na detecção de antigénios de Streptococci, Cryptococcus neoformans e agentes de meningite bacteriana, sendo ainda usada na pesquisa de anticorpos contra o vírus citomegálico e o vírus da rubéola.

Na co-aglutinação, há duas reacções de aglutinação em simultâneo. Como exemplo, refira-se o uso de estirpes de Staphylococcus aureus como transportadores inespecíficos de imunoglobulinas (anticorpos) contra determinados antigénios. A maioria das bactérias desta espécie possui uma proteína de superfície (proteína A), que tem elevada afinidade para o segmento Fc das imunoglobulinas IgG1, IgG2, IgG4, anticorpos que, por sua vez, se ligam especificamente ao antigénio a pesquisar (co-aglutinação).

As reacções de floculação são um caso particular de aglutinação, em que as partículas são muito pequenas e, por vezes, apenas visíveis ao microscópio. São exemplos de utilização da floculação (com partículas visíveis macroscopicamente) algumas provas serológicas da sífilis, que se revestem de grande importância quando não é possível visualizar directamente o agente.




Fixação do Complemento
Nesta reacção, pesquisa-se a presença de anticorpos no soro do doente, colocando-o em contacto com uma solução conhecida de antigénios. Se o doente possuir anticorpos formam-se complexos antigénio-anticorpo. Adiciona-se depois o complemento, que pode ser fixado (se houver complexos antigénio-anticorpo) ou não. Um sistema indicador (por exemplo, eritrócitos sensibilizados ao complemento) diz-nos se houve ou não consumo de complemento. Se houve, não se observam alterações nos glóbulos (reacção positiva); se não houve fixação do complemento, ele vai fixar-se aos glóbulos rubros sensibilizados, lisando-os (reacção negativa).

Os testes de fixação do complemento, feitos sobretudo em laboratórios de referência, são úteis para o diagnóstico de infecções por alguns vírus respiratórios, Influenza A e B, Parainfluenza, Adenovírus e Arbovírus, bem como em algumas doenças fúngicas e na febre Q.



Imunofluorescência
A imunofluorescência pode usar-se para pesquisar a existência de antigénios em células (eucariotas e procariotas) ou tecidos (imuno-histologia). Pode ser directa ou indirecta.

Na directa, adiciona-se à amostra a estudar uma solução de anticorpo fluoresceinado (ligado a uma substância fluorescente). Depois de incubar e lavar, observa-se ao microscópio de fluorescência, cuja fonte luminosa é a luz ultravioleta. A observação de fluorescência revela a presença do antigénio.

Na imunofluorescência indirecta, adiciona-se primeiro um anticorpo específico para o antigénio a pesquisar, visualizando-se depois a reacção através da adição de uma anti imunoglobulina fluoresceinada, seguida de incubação, lavagem e observação ao microscópio de fluorescência.

Há testes de imunofluorescência disponíveis comercialmente para detectar anticorpos contra Legionellae, Borrellia burgdorferi, Toxoplasma gondii, vírus Varicella zoster, vírus citomegálico, diversos antigénios do vírus Epstein-Barr, vírus Herpes simplex I e II, vírus da rubéola, Mycoplasma pneumoniae, Treponema pallidum pallidum (FTA-ABS) e várias Rickettsiae.



ELISA
O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) é um método semelhante à imunofluorescência, com boa sensibilidade, que usa uma enzima (por exemplo a peroxídase) em vez da substância fluorescente. Em seguida, é adicionado um substracto que muda de cor sob a acção da enzima, fazendo-se a leitura visualmente ou com o auxílio dum espectrofotómetro.

Hoje em dia, os sistemas ELISA são largamente usados nos laboratórios de Microbiologia, permitindo a detecção de antigénios ou anticorpos em relação a um vasto número de agentes infecciosos (bacterianos, fúngicos, parasitários e víricos).



RIA
O RIA (radioimmunoassay) é usado essencialmente para pesquisar antigénios em amostras séricas (nomeadamente hormonas ou proteínas), mas também pode ser usado para determinar anticorpos. No diagnóstico de doenças infecciosas, é usado essencialmente na detecção de antigénios ou anticorpos dos vírus de hepatite, enterovírus e Legionella.

Os anticorpos do doente (não marcados) competem com anticorpos marcados radioactivamente para os mesmos locais de ligação em quantidades definidas de antigénio. A quantificação de anticorpos do doente é feita através da redução da radioactividade do complexo antigénio-anticorpo, quando comparado com um controle em que só existia anticorpo marcado (sem o soro do doente), fazendo-se a leitura da radioactividade numa gama-câmara.

O desenvolvimento da imunofluorescência e dos testes imuno-enzimáticos (ELISA) vem relegar para segundo plano o RIA, uma vez que torna disponíveis testes tão sensíveis como este último sem os riscos inerentes à radioactividade.

Teste do lisado de Limulus
Em 1964 foi descoberto que a hemolinfa de uma espécie de caranguejo (do género Limulus) gelificava na presença de endotoxina, devido à existência de células especiais (amebócitos). A partir daí desenvolveu-se o teste LAL (Limulus amebocyte Iysate), que identifica endotoxina de bactérias Gram negativas presente nos fluídos corporais, sendo altamente sensível.

Efeitos na actividade microbiana
Há um conjunto de testes que se baseiam na capacidade dos anticorpos inibirem determinada propriedade biológica dos microrganismos em questão. São exemplos destas técnicas a neutralização de toxinas ou enzimas, através da anulação da actividade dessas substâncias pela reacção antigénio-anticorpo, o bloqueio da actividade metabólica de microrganismos em cultura, a imobilização de bactérias flageladas e outras situações análogas. No caso particular de vírus citopáticos, podem ser pesquisados anticorpos que reduzam a infecciosidade vírica através da diminuição da morte celular em culturas de células infectadas pelo vírus.

A pesquisa do título de anti-estreptolisina O no soro do doente é um exemplo de reacção de neutralização. A estreptolisina O é uma das hemolisinas produzidas pelos Streptococci, que induz, no indivíduo infectado, a produção de anticorpos (anti-estreptolisina O). A pesquisa faz-se colocando o soro do doente (em diluições seriadas, para determinar o título) em contacto com uma quantidade fixa de estreptolisina O e glóbulos rubros de carneiro (indicador). A observação de hemólise corresponde à primeira diluição em que a quantidade de anticorpos do soro do doente, presentes no tubo, não é capaz de neutralizar toda a estreptolisina O, logo, esta vai manifestar-se, daí em diante, hemolisando os glóbulos.


Immunoblotting
No immunoblotting, as proteínas das amostras (antigénios) são submetidas a electroforese num gel de poliacrilamida e após a sua separação são transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Esta é tratada com o anticorpo marcada com sonda radioactiva.

As bandas antigénicas que tenham fixado anticorpo são então visualizadas por auto-radiografia. A técnica pode ser modificada para que a detecção seja feita por métodos imuno-enzimáticos.


Biologia Molecular


  • A Biologia molecular veio revolucionar o diagnóstico em Microbiologia.

  • São objectivos desta aula o domínio de uma linguagem própria da Biologia molecular anexando-se por isso um glossário; compreender as vantagens e os inconvenientes desta tecnologia comparativamente à metodologia clássica e ainda as suas aplicações à microbiologia.

  • Pretende-se um conhecimento, ainda que superficial, de algumas estratégias utilizadas no diagnóstico por biologia molecular


Texto de apoio

Glossário


DNA – sequência repetitiva de quatro nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) dispostas em dupla hélix ligada por pontes de hidrogénio (dsDNA); “Single strand” de DNA (ssDNA)
RNA – sequência repetitiva de quatro nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e uracilo) dispostas em cadeia simples
Desnaturação – separação de duplas cadeias por destruição das pontes de hidrogénio por calor, pH alcalino
Hibridização – processo de “reannealing” – ligação de cadeias de diferentes origens

ex: RNA-RNA, RNA-ssDNA, DsDNA-ds-DNA


Probe” – Sonda ou Primer – Curta sequência de ácidos nucleicos complementar de regiões específicas do alvo resultando numa hibridização estável
Probe array” – “gene chip” – colecção de numerosos oligonucleotídos presos a uma superfície de silicone
Extracção – método químico de isolamento de ácidos nucleicos
Ampliconproduto amplificado
Genotipagem – análise sequencial dos nucleotídeos
Detecção – processo de visualização da reacção
Escolha do alvo – depende do objectivo.

Pode detectar género, espécie ou até estirpe

Alvos de DNA são os mais específicos porque contêm regiões únicas

Alvos de RNA também são usados porque há mais cópias de RNA que de DNA o que aumenta a sensibilidade da detecção. RNAm pode também ser utilizado com a vantagem de distinguir células dormentes de células em crescimento activo. RNAr é o alvo mais usado em provas de “screening”. RNAr é muito mais “conservado” (menor variabilidade) que RNAm e há mais cópias que de DNA; excepto nos vírus que não têm RNAr. DNA plasmídico, DNA extracromossómico também pode ser usado como alvo; as limitações é que os plasmídeos podem estar presentes em células não alvo.



Seja DNA ou RNA, o melhor alvo é a sequência de nucleotídeos só presente em células alvo - especificidade.
Especificidade – o alvo deve ser único e a sonda deve hibridizar especificamente com ele e não consigo própria ou com locais fora do alvo. Não é preciso saber as funções da sequência.
Selecção da “Probe” ou sonda – a sua produção é muito fácil desde que se conheça o alvo.

“Probe” ideal – sequência de cadeia simples, DNA ou RNA que possa hibridizar com o alvo pretendido



  • isolamento da mesma

  • reprodução em grandes quantidades

  • ligação a compostos de modo a ser detectada


Tamanho da “probe” (sonda): de 10 bases a 10000, o mais frequente é de 14 a 40 pares de bases. É necessário o mínimo de 20 nucleotídeos.

Sequências curtas - hibridização mais rápida, risco de menor especificidade, mais difíceis de marcar

Sequências longas - hibridização mais estável a altas temperaturas e baixa concentração de sais
“Kits” comerciais preferem sondas pequenas de rápida hibridização, longa estabilidade, facilidade de preparação e capacidade de detecção de alterações menores no alvo
Marcação da sonda – é fundamental que a existência de hibridização seja revelada. Os marcadores podem ser incorporados ou ligados à sonda: 32P, 35S, 125I; fosfatase alcalina, peroxidase, biotina revelada por enzimas ligadas à avidina, ou ainda a fluorocromo .

A marcação radioactiva normalmente é mais sensível mas com mais falsos positivos e com os inconvenientes da radioactividade.



Vantagens em relação a outros métodos





  • métodos culturais

necessitam manutenção da viabilidade dos microrganismos; dependem da velocidade de crescimento dos mesmos


  • métodos de detecção antigénica
    menor especificidade




  • métodos serológicos
    dependem da resposta imunológica do hospedeiro; RN /mãe






Aplicações em Bacteriologia, Micologia, Parasitologia e Virologia





  • Aplicações nas diversas áreas

  • Epidemiologia

  • Diagnóstico

  • “Follow-up”

  • Resistências a fármacos

Em cada caso comparar com outras técnicas



Estratégias de Hibridização

calor/alto pH



dsDNA--------------------------ssDNA

" reanneal"


RNA-------------------------------RNA
Líquida
Sólida: “dot” ou “blot”

mais usada






Métodos de Amplificação - processo pelo qual múltiplas cópias de ácidos nucleicos são produzidos o que aumenta enormemente a sensibilidade da detecção


PCR


Mullis, 1983; o método de amplificação de ácidos nucleicos mais frequentente usado, principalmente de DNA. Três fases fundamentais :

    • desnaturação dsDNA em ssDNA

    • “primers annealing" ao ssDNA

    • e
      xtensão da síntese da cadeia complementar a ssDNA para formar cDNA

É necessário fornecer nucleotídeos e enzimas para a reacção


46E




LCR

Enquanto no PCR se sintetiza moléculas de DNA a partir de oligonucleotídeos individuais, aqui é usada uma enzima termoestável que liga 2 oligonucleotídeos imediatamente adjacentes.


Desnaturação, “annealing” e ligação. 20 a 30 ciclos amplifica 106 vezes o alvo original
variedade: G-PCR “gapped-LCR”

envolve o uso de Taq e Ligase; 2 oligonucleotídeos “primers” que são “anneled” ao alvo mas ficam com um espaço entre eles que é preenchido com a ajuda da Taq.






Amplificação do sinal
bDNA

detecção por quemiluminescência da ligação do alvo ao DNA ramificado;

promissora quanto à possibilidade de quantificação



Diagnóstico indirecto (Serologia)

Objectivos e o texto de apoio – consultar a aula nº 14 (pág. 45 e seguintes)



Execução prática



  • Realizar provas de aglutinação para pesquisa e quantificação de anticorpos – reacção de Wright, Widal e Weil-Félix

  • Realizar (se possível) ou apenas observar resultados obtidos com outras técnicas serológicas


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