Permeabilidade celular



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PROT-09

DISCIPLINA DE BIOFÍSICA


Nome:___________________________________ Turma:_____ Data:___/___/___

PERMEABILIDADE CELULAR
Objetivo: Determinação da permeabilidade da membrana do eritrócito para diversas substâncias.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
As membranas celulares são estruturas altamente especializadas, contendo moléculas carregadoras, sítios receptores de hormônios e sítios de reconhecimento molecular. O maior ou menor conteúdo de proteínas nas mesmas se relacionam com diferentes capacidades funcionais dessas membranas. A permeabilidade das membranas celulares varia com os diferentes tipos de células e representa a capacidade de se deixar atravessar por uma determinada substância. Esta deve passar através da membrana, sendo que o processo de passagem por endo e exocitose não implicam em permeabilidade.

Para determinar a permeabilidade da membrana de eritrócitos a várias substâncias, deveremos registrar os tempos de hemólise dos eritrócitos postos em contato com soluções isosmóticas dessas diferentes substâncias. A entrada de uma substância na célula modifica a osmolaridade no compartimento intracelular, dando-se, pois, um influxo osmótico de água no sentido de reestabelecer condições de isosmoticidade. Porém, a entrada adicional de soluto permeante leva a um novo desequilíbrio osmótico e mais água penetra na célula segundo o seu gradiente de concentração, levando por fim a uma hemólise osmótica da célula. Para quaisquer substâncias que penetrem com menor facilidade que a água, os tempos de hemólise estarão relacionados com a magnitude de seus respectivos coeficientes de permeabilidade e pode-se assim determinar a permeabilidade relativa de um grupo de substâncias.

Assim, é possível relacionar as propriedades das moléculas permeantes tais como, tamanho, peso molecular, coeficiente de partição água-óleo e o grau de permeabilidade da membrana. Da mesma forma, pode-se ter informações sobre a constituição de uma membrana de acordo com o tipo de moléculas que a permeiam com maior ou menor facilidade.

A permeabilidade de uma substância pode ser definida como a taxa de transporte através da membrana celular, quando a força impulsionanante é unitária.


A 1ª Lei de Fick diz:
dN dC

Fluxo = J = ----- = - D.A. ---- ,onde

dt dx

D= coeficiente de difusão; dC dN

----- = gradiente de concentração e ----- = Taxa de transporte

A= área de difusão; dx dt
Quando o transporte se faz através de uma membrana, em que se desconhece o coeficiente de difusão (D) e a espessura efetiva da membrana (X), o fluxo (J), a concentração interna (Ci) e a concentração externa da substância (Ce) podem ser determinadados experimentalmente, relacionando-as como segue:

Ce-Ci D (Ce-Ci)

J = A.D. -------- ou J = A ------------

Xm Xm


D

----- = P (Coeficiente de Permeabilidade),logo: J = P.A.(Ce-Ci)

Xm
Nessas condições o tempo de hemólise (th) será proporcional ao influxo da substância, este, por sua vez, é proporcional ao coeficiente de permeabilidade (P).

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Pipete 3 ml de cada uma das seguintes soluções em tubos de ensaio devidamente rotulados.

. - etanol 0,30M - glicerol 0,.30M

- cloreto de sódio 0,15M - propanol 0,30M - água

- glicose 0,30M - uréia 0,30M

2) Coloque em um dos tubos 1 gota (0,20 ml) de sangue e homogenize imediatamente, emborcando o tubo uma vez e iniciando neste momento a contagem de tempo do segundeiro do relógio. Anote o tempo necessário para que o traço na parede do tubo seja nitidamente visível. Repita, separadamente, a operação para as demais soluções.


RELATÓRIO DA PRÁTICA

No quadro a seguir, temos uma lista de substâncias, bem como algumas de suas propriedades estruturais e físico-químicas. As quatro últimas colunas do quadro devem ser preenchidas conforme as instruções.


Osm - Osmolaridade das soluções empregadas

Th - Tempo de hemólise medido

Pr - Permeabilidade relativa

Cálculo de Pr: para se calcular a permeabilidade relativa, considere o tempo de hemólise (th) da uréia como sendo igual a 1. A permeabilidade relativa das outras substâncias é calculada dividindo-se o th da uréia pelo th da substância.

Considerando fatores como tamanho, carga e coeficiente de partição das substâncias, proponha o possível mecanismo de transporte através da membrana.

A membrana comporta-se como se tivesse poros de cerca de 0,6 nm de diâmetro, que dão acesso ao interior da célula a substâncias não-lipossolúveis, contanto que elas sejam suficientemente pequenas e sem carga.




Substância

Mr

Fórmula

Ä


Solub.

[M]

[Osm]

Th

Pr


Mecanismo de transporte

NaCl

58,5

NaCl

5,12 Na+

3,86 Cl-



Água-S

Óleo-i


0,15













Glicose

180

C6 H12 O6

8,6

Água-S

Óleo-i


0,3













Etanol

46

CH3 CH2 OH




Água-S

Óleo-S


0,3













Propanol

60,1

CH3 CH2 CH2OH




Água-S

Óleo-S


0,3













Uréia

60,6

CO (NH2 )2

3,6

Água-S

Óleo-i


0,3













Glicerol

92,1

CHOH(CH2 OH)2

6,2

Água-S

Óleo-S


0,3













Água

18

H2 O

3

Água-S















S = solúvel i = insolúvel




  1. Por que ocorre hemólise das hemácias em algumas dessas soluções e em outras não, apesar de todas serem isosmolares?

2) Explique porque três álcoois (etanol, propanol e glicerol) tem th diferentes.


3) Quais das soluções acima são isotônicas? Por quê?



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