PreparaçÃo e ensaios in-vitro de um biovidro para aplicaçÃo em preenchimento ósseo



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Anais do 47º
Congresso Brasileiro de Cerâmica

Proceedings of the 47th Annual Meeting of the Brazilian Ceramic Society

15-18/junho/2003 – João Pessoa - PB - Brasil



ENSAIOS IN-VITRO DE UM BIOVIDRO PARA PREENCHIMENTO ÓSSEO

L. Novaki, H.I. Tsai, E. da Costa, A.V.C. Andrade, M.B. Marques, C.P.F. Borges, S.R.M. Antunes, L.T.P. Pereira, F.J. dos Santos, D. Migliorini, J.C. Zurita

da Silva

DEQUIM-CIPP

Av. Carlos Cavalcanti, 4748 – Uvaranas – 84030-900 – Ponta Grossa – PR

e-mail: jzurita@uepg.br


Universidade Estadual de Ponta Grossa



RESUMO




Os biovidros com composição Na2O-CaO-SiO2-P2O5 podem ser usadas para aplicações como biomateriais. Estes materiais na forma de pós ou blocos e preparados de forma adequada possuem a capacidade de induzir osteocondutividade quando utilizados para preencher cavidades ósseas, possibilitando, assim, o crescimento e regeneração do tecido ósseo em recuperação. O biovidro foi preparado a partir de óxidos puros e caracterizados por análise química e difração de raios X, e verificou-se que o biovidro apresenta estequiometria química definida sendo de característica não cristalino. A análise por MEV mostra que as partículas têm tamanho médio de 1 µm. Ensaios in-vitro em meio de solução de hemácias utilizando partículas de biovidro foram realizados de modo estático (37°C) e dinâmico ( 25°C) por um período de 2 horas sobre lâminas de vidro. Análise de microscopia eletrônica de varredura das lâminas indicaram que as hemácias permaneceram intactas em ambos ensaios.
Palavras-chave: Biovidros, sinterização, ensaios in-vitro.

INTRODUÇÃO



Materiais biocompativeis, tais como fosfatos tricálcicos, hidroxiapatita e vidros bioativos podem ser efetivos no reparo de defeitos ósseos em ortopedia, uma vez que estes materiais exibem diferentes graus de comportamento no processo de crescimento e evolução de osteoblastos na estrutura óssea(1). Os vários biovidros a base de SiO2 - Na2O - CaO - P2O5, em diferentes composições são conhecidos por serem particulados altamente bioativos e têm sido usados nas clínicas como material de preenchimento ósseo de cavidades e como substituto de massa óssea perdida em determinados traumas. Estes biovidros são indutores de formação de trabéculas no osso em algumas regiões, num período de 2 a 7 dias, e de partes de osso que são formados num maior período de tempo(2). Entretanto, análise qualitativa e quantitativa de ensaios in-vivo na geração de ossos é importante para se estabelecer a propriedade química e física do material de implante(3). Os biovidros a base de 45% SiO2 -24,5% Na2O -24,5% CaO - 6% P2O5 apresentam bioatividade quando inseridos em meio aquoso, nos ensaios in-vitro em fluido de corpo simulado, que contém todos os íons presentes no fluido de um corpo vivo, estes biovidros perdem íons sódio ao meio e formam um filme superficial rico em SiO2, o que provoca a formação de uma camada de gel de fosfato de cálcio inicialmente amorfo e gradualmente muda para uma camada policristalina de aglomerados de apatita o qual podem ser incorporados, por exemplo, na estrutura do colágeno. Esta camada formada é importante para que o processo de dissolução do vidro se estabilize e possibilite que processos físico-químicos ocorram e formem ligações químicas entre a superfície vítrea e o tecido ósseo recém formado na região de intervenção cirúrgica(4}. O fenômeno de osteogenese direcionada por partículas de biovidros ativos com uma larga distribuição granulométrica foi explicado por Scheppers et al(5). A troca iônica interfacial entre as partículas de biovidros e os fluidos dos tecidos vizinhos, resulta na formação de sílica gel, a qual é coberta rapidamente por uma camada rica em cálcio-fósforo(6). Recentemente a estrutura de silicatos minerais como wollastonita (CaSiO3) (7), e diopsida (CaMgSi2O6) (8), tem sido preparados sinteticamente para uso como materiais cerâmicos bioativos. A superfície cerâmica inicialmente reage com o fluido fisiológico das vizinhanças, portanto a natureza do sólido formado na superfície é determinada pela química da cerâmica e os constituintes do fluido de corpo simulado(9). Um novo processo de preparação de cerâmicas bioativas porosas com porosidade interconectada em cerâmicas densas foi desenvolvido usando uma solidificação lenta da composição eutética do sistema CaSiO3-Ca3(PO4)2 que são as chamadas cerâmicas bioeutéticas, e possuem a habilidade de reestruturar sua morfologia quando imersos em meio de fluido de corpo simulado(10). Este trabalho tem aplicação na área de implantes dentais, onde biovidros e cerâmicas do sistema Na2O-CaO-SiO2-P2O5 apresentam uma boa bioatividade e uma boa biocompatibilidade para uso como material de preenchimento ósseo. Entretanto este material deve apresentar compatibilidade com as funções requeridas pelo organismo, bem como um controle sobre a interface tecido-biomaterial. Esses materiais podem ser vidros, vitrocerâmicas, cerâmicas ou metais. Assim , neste trabalho preparou-se um biovidro com características físico-químicas adequadas para preenchimento ósseo e avaliou-se as partículas de biovidro puro não cristalino e biovidro sinterizado com relação a sua bioatividade e biocompatibidade em meio de solução de hemácias.
MATERIAIS E MÉTODOS
Preparação do pó.

Preparou-se uma mistura de pó, com composição 12% Na2O – 28% CaO – 10% P2O5 e 50% SiO2 em peso, partiu-se de reagentes puros e anidros: Na2CO3, CaO, Na2H PO4, SiO2. Colocou-se o pó dentro de um cadinho de platina e levou-se para fusão em um forno elétrico a 1450°C por um período de 4 horas. Retirou-se rapidamente o fundido do forno e colocou-se dentro de um recipiente contendo água destilada, assim formaram-se grânulos de vidro. Em seguida os grânulos foram triturados em um jarro de polietileno e cilindros de zircônia durante 6 horas.


Sinterização e caracterização do pó.

O pó de biovidro foi levado em cadinho de platina a um forno por um período de 2 horas a temperaturas de 660, 800, 840 e 900°C, sendo em seguida caracterizado por difratometria de raios X com relação às fases cristalinas presentes.


Preparo da solução de hemácias.

Utilizando-se de sangue obtido em banco de sangue, foi levado a centrífuga a 700 rpm por 15 minutos em tampão PBS(tampão fosfato de potássio 5,0 mM, NaCl 0,154 mM, pH=7,4), sendo o precipitado final constituido apenas de eritrócitos (hematócrito 100%).


Ensaios in-vitro.

Para os ensaios in-vitro de biovidro puro e biovidros sinterizados a temperaturas de 800, 840 e 900°C, os testes foram conduzidos de forma estática a 25° C e 37°C e dinâmica a 25oC, por 2 horas, nos quais incubou-se em 0,8% de hematócrito com 6 mg de pós de biovidro em placas de vidro por um período de 2 horas. Posteriormente, as placas foram fixadas com Magrin(MG) e coradas pelo método de giemsa(GC), sendo em seguida analisadas por microscopia eletrônica de varredura de marca JEOL e modelo JSM-II.


RESULTADOS E DISCUSSÃO
A caracterização do biovidro puro não-cristalino por análise de fluorescência de raios X, indica a composição percentual sendo de: 22,1% CaO; 55,5% SiO2; 13,1% Na2O e 10,1% P2O5. Portanto o pó de biovidro em estudo encontra-se na faixa de bioatividade, segundo o diagrama de fases(11).

Este resultado inicial de análise química é importante pois a capacidade de bioatividade se deve aos componentes presentes na amostra que permitem a interação através de suas partes de cargas iônicas interagirem com outros grupos também carregados eletricamente, no caso grupamentos carboxílicos, amínicos ou grupos com elétrons disponíveis pertencentes a proteínas, enzimas e membranas dos tecidos ósseos e cartilaginosos(4). A análise por técnica de difratometria de raios X, indica também que o biovidro apresenta ligações de curta ordem, característico de material não cristalino.

O comportamento térmico do biovidro foi determinado por análise térmica diferencial(DTA). Observou-se que a temperatura de transição vítrea ocorre na região endotérmica de 530 oC a 580 oC e os picos exotérmicos de nucleação e cristalização a 600 oC e 680 oC respectivamente. O resultado de DTA é essencial para a determinação da temperatura de sinterização do biovidro não cristalino. No caso utilizou-se o tratamento térmico de: 660, 800, 840 e 900 oC ou seja, temperaturas próximas as de cristalização. Para o processo de sinterização de pós de biovidros, observou-se o controle de granulometria dos pós na média de 6 micras, para o ensaio dos pós em meio de suspensão de hemácias. Os resultados de difratometria de raios X, Figura 1, indicam a evolução de fases cristalinas com o aumento de temperatura de sinterização. Verifica-se que a amostra tratada termicamente a 660 oC, apresenta um intenso e largo espectro, característico de material não cristalino e alguma fase se formando na matriz da cerâmica vítrea. Alguns autores (2) discutem o fato da presença de fase não cristalina e uma pequena quantidade de cristalitos, o que favorece a interação interfacial do biovidro com o meio fisiológico(7). As fases cristalinas indicativas de majoritárias aparecem na forma de: SiO2(S), Na2Ca2Si3O9(NCS), CaSiO3(CS) e Na2CaPO4(NCP), que apresentam característica de realizar possíveis interações com o meio através de seus grupamentos de sílica, fosfatos e silicatos e surgem a 800 e 840 oC.

a –800oC

b –840oC


S

S

CS

NCS

NCP

2-

Figura 1 : Difratograma de raios X de amostra de biovidro puro sinterizado: a-) 800 oC e b-) 840 oC, por um período de 2 horas.


Ensaios in-vitro de pós de biovidros na forma não-cristalina e sinterizados a 800 e 840oC, foram realizados em meio de suspensão de hemáceas 0,8% em PBS(norma ASTM-756-93) utilizando 5 mL de suspensão e 6 mg de partículas de biovidro incubando em condições estáticas e dinâmicas. Após o período de 2 horas, procedeu-se o tingimento e fixação com corante giemsa e magrin sendo em seguida analisados por MEV. Os resultados obtidos indicam que o biovidro cristalino sinterizado a 800oC, Figura 2, não provoca hemólise mecânica nas hemácias, como se observa na célula inteira da hemácia mostrando sua concavidade, na parte central da micrografia, a qual está envolvida por partículas de biovidro que estão adsorvidos na superfície da hemácia. Na Figura 3, observa-se também que ocorre interação química na superfície da hemácia em presença de biovidro não cristalino, e na Figura 4, verifica-se duas células que estão em processo de diminuição de seu tamanho, que pode ter sido devido ao manuseio na análise por MEV, ou a mudança da força iônica do meio quando do processo de lavagem, tingimento e fixação, provocando a ruptura da parede celular, e extravazando o seu líquido interno em sua volta. Outros ensaios estão sendo realizados para se confirmar o processo que provocou a ruptura de algumas células para as amostras ensaiadas.

Figura - 2 : Micrografia eletrônica de varredura de amostra de biovidro sinterizado a 800 oC e ensaiada a 37 oC de modo estático. Por um período de 2 horas em meio de suspensão de hematócrito.

Figura - 3 : Micrografia eletrônica de varredura de amostra de biovidro não cristalino e ensaiada a 37 oC de modo estático. Por um período de 2 horas em meio de suspensão de hematócrito.



Figura - 4 : Micrografia eletrônica de varredura de amostra de biovidro não cristalino e ensaiada a 37 oC de modo estático. Por um período de 2 horas em meio de suspensão de hematócrito


CONCLUSÃO
Neste trabalho conclui-se que as partículas de biovidro preparadas e ensaiadas in-vitro apresentam bioatividade e biocompatibilidade, tanto na forma não cristalina e na cristalizada uma vez que as hemácias se mantêm intactas e inclusive adsorvem-se nas superfícies das partículas. Isto se deve a presença de grupamentos químicos tais como os carboxílicos, amínicos, hidroxílicos, fosfatos, disponíveis na interface partícula-parede celular.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq-PIBIC, Fundação Araucária, CAPES e IQAr-UNESP.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. STANFORD, J.W.; Bone-inducing materials: Their place in dentistry, Int. Dent. J., 37 162-168 (1987).

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4. STRNAD, Z., Role of the glass phase in bioactive glass-ceramics, Biomaterials, 5 317 - 321 (1992).

5. SCHEPERS, E.; De CLERCQ, M.; DUCHEYNE, P.; Bioactive glass particulate material as a filler for bone lesions, J.Oral Rehabil., 18 439 - 452 (1991).

6. SCHEPERS, E.J.G.; DUCHEYNE, P.; BARBIER, L.; Bioactive glass particles of narrrow size range: A new material for the repair of bone defects, Implant Dentistry, 3 151 - 156 (1993).

7. De AZA, P.N.;GUITIAN, F.; De AZA, S.; Bioactivity of wollastonite ceramics: in vitro evaluation, Scripta Materialia, 8 1001 - 1005 (1994).

8. MIAKE, Y.; YANAGISAWA, T.; YAGIMA, Y.; NOMA, H.; YASUI, N.; NONANI, T.; High resolution and analytical electron microscopy studies of new crystals induced by a bioactive ceramic(diopside), J. of Dental research, 11, 1756 – 1763 (1995).

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10. De AZA, P.N.; LUKLINSKA, Z.B.; ANSEAU, M.R.; HECTOR, M.; GUITIÁN, F.; De AZA, S.; Reactivity of a wollastonite-tricalcium phosphate bioeutetic ceramic in human parotid saliva, Biomaterials, 21, 1735 – 1741 (2000).



11. BARBATO, D.A.; IANKE, C.; CORRÊA, D.T.S.; BATISTA, E. A; ANDRADE, A C.V.; JANASI, S.; SANTOS, F.J.; ANTUNES, S.R.M.; ZURITA DA SILVA, J.C., Obtenção de um biovidro a base de fosfato de cálcio para preenchimento ósseo, ANAIS: Congresso Brasileiro de Ciência dos Materiais do Mercosul – CCT/UDESC, Setembro/2000, 387 - 393 (2000)

ABSTRACT




IN –VITRO ASSAYS OF AN BIOGLASS FOR FILLING OSSEOUS



A bioglass with composition 12%Na2O-28%CaO-50%SiO2-10%P2O5 can be used as biomaterials. These ceramic materials prepared in adequate form show the capacity to induce osteoconductive behaviour when used for filling cavities, and possibility the growth and regeneration of bone tissue. The bioglass were prepared from pure oxides and characterized by chemical analysis and X ray diffraction. The results indicated that the bioglass are stoichiometric and non-crystalline. The scanning electron microscopy (SEM) analysis showed the range distribution granulometric of particles of 1 m. Assays in media of blood suspension was realized using bioglass particles in static (25º and 37ºC) and dinamic (25ºC) method for 2 hours in a glass surface sheets. The MEV analysis indicated that the hematocrite cells are intacte in both assays.




Key-words – Bioglass, sinterization, in-vitro assays



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