Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos



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Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos
Valéria Maia de Oliveira, Lara Durães Sette e Fabiana Fantinatti-Garboggini

Divisão de Recursos Microbianos

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)

Universidade Estadual de Campinas

Caixa Postal 6171, CEP: 13081-970, Campinas, SP.

E-mail: vmaia@cpqba.unicamp.br; lara@cpqba.unicamp.br e fabianaf@cpqba.unicamp.br




Resumo

Os microrganismos são as entidades bióticas mais numerosas e antigas, capazes de colonizar com sucesso cada nicho ecológico possível do planeta. Suas presença e atividade são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos ecossistemas. Além disso, os microrganismos representam uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. Estratégias tradicionais de isolamento e seleção de microrganismos têm garantido o desenvolvimento de novos fármacos e aplicações nas áreas de saúde, agricultura, indústria e meio ambiente. Nos últimos anos, novas abordagens de trabalho, envolvendo metodologias de bioinformática e biologia molecular, vêm permitindo a prospecção in silico de informações a partir de dados genômicos em bases de dados e a análise de microrganismos sem a necessidade de isolamento e cultivo, a partir da clonagem direta de DNA de amostras ambientais (metagenoma). A devida caracterização e preservação dos recursos microbianos são fatores de fundamental importância para o desenvolvimento da bioeconomia no século 21. Neste contexto, as Coleções Biológicas ou Centros de Recursos Biológicos desempenham papel relevante como centros de conservação da biodiversidade e são responsáveis pela aquisição, caracterização, autenticação, preservação e distribuição de material biológico com conformidade assegurada.


Palavras chaves: Biotecnologia; diversidade microbiana; genômica; metagenômica; Centros de Recursos Microbianos.

Introdução

À exceção de animais e plantas superiores, o conhecimento da diversidade biológica em termos de riqueza de espécies, distribuição local e global, e função no ecossistema, permanece ainda bastante incompleto.

A evolução das metodologias de biologia molecular aplicada ao estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana (1). Resultados de estudos independentes de isolamento e cultivo, baseados em amplificação e seqüenciamento de fragmentos de genes do operon ribossomal, demonstraram que apenas uma pequena fração dos microrganismos (<10% em solos e <1% em ambientes aquáticos) é usualmente recuperada em estudos baseados em isolamento e cultivo. A utilização das metodologias moleculares levou, portanto, a uma drástica mudança na perspectiva da diversidade microbiana existente no ambiente, sendo que um levantamento recente apontou como 53 o número de divisões dentro do Domínio Bacteria, das quais aproximadamente 50% não possuem representantes cultivados (2).

Frente à vasta diversidade representada pelos microrganismos ainda não-cultivados e às limitações de cultivo e manipulação de organismos extremófilos em laboratórios (hipertermófilos, psicrófilos e barofílicos, entre outros), torna-se premente a necessidade da adoção de novas estratégias para a exploração plena e preservação dos recursos genéticos microbianos.

Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a diversidade microbiana são extensos (3) (4), entre outros, a melhor compreensão das funções exercidas pelas comunidades microbianas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros componentes da biodiversidade. Os benefícios econômicos e estratégicos estão relacionados com a descoberta de microrganismos potencialmente exploráveis nos processos biotecnológicos para: novos antibióticos e agentes terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes e biolixiviação e recuperação de minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e prevenção de doenças emergentes em seres humanos, animais e plantas, e a otimização da capacidade microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas.
Exploração da Diversidade Microbiana

Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente e contribuem para a estabilidade de ecossistemas, sendo também responsáveis pela ciclagem dos compostos químicos, incluindo a degradação de poluentes ambientais. Apesar de sua grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% dos microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (5). O conhecimento da biodiversidade e bioprospecção de novos microrganismos tornaram-se uns dos focos principais da era biotecnológica, visto que a utilização destes organismos na busca de soluções nas áreas de alimento, saúde, meio ambiente e indústria vem crescendo de forma acelerada no atual cenário mundial.

A extraordinária atividade dos microrganismos está baseada em sua notável diversidade metabólica e adaptabilidade genética (6), o que os torna uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento sustentável. São vários os exemplos que atestam a utilização de recursos microbianos pelo homem em diversas atividades de importância sócio-econômica: na área industrial, os microrganismos são empregados na produção de compostos comerciais ou para transformação de substratos em produtos de maior valor agregado; na agropecuária, destacam-se os microrganismos fixadores de nitrogênio e os empregados no controle biológico de pragas e vetores; na área de alimentos, as linhagens microbianas são empregadas na produção de bebidas, panificação, queijos, ácidos orgânicos, enzimas, dentre outros; e na área ambiental, as perspectivas de recuperação do meio ambiente através da biorremediação são bastante promissoras e dependentes de novos isolados.

A exploração dos microrganismos pela indústria gera bilhões de dólares a cada ano (6). O valor dos microrganismos é geralmente avaliado pela potencial aplicação direta nos processos biotecnológicos ou valor de mercado dos produtos derivados, sendo muito menos contemplados os valores associados aos benefícios ambientais e sociais decorrentes do tratamento de resíduos industriais e poluição ambiental.

O sucesso dos processos biotecnológicos está diretamente relacionado com a diversidade dos microrganismos e das moléculas que eles produzem como resultado do metabolismo primário e secundário, bem como com a conservação dos recursos genéticos que eles fornecem (4). Conseqüentemente, o aumento da diversidade de compostos químicos para os diferentes setores industriais está associado com a exploração da diversidade microbiana e são muitos os benefícios científicos esperados como resultado desta exploração (3) (4).

Resumidamente, um processo de busca e descoberta de produtos naturais a partir dos recursos microbianos passa pela coleta de material biológico, pré-seleção e triagem de materiais, seleção final do(s) melhor(es) candidato(s) a partir de uma lista reduzida de opções e culmina com o desenvolvimento de um produto comercial ou processo industrial (7). Entretanto, este processo vem sofrendo profundas alterações em função das mudanças de modelos desencadeadas pelos avanços em biologia molecular, genômica, metagenômica e bioinformática.


Impacto da Genômica na descoberta de novos produtos bioativos

A genômica corresponde à área da ciência que pesquisa e desenvolve tecnologia para a investigação da estrutura e organização dos genes de um determinado organismo, fornecendo um catálogo completo dos genes e das proteínas presentes no mesmo. Assim, o objetivo atual é conhecer o conjunto de todos os genes de um organismo (isto é, o genoma) e compreender as redes funcionais que se estabelecem entre as proteínas por eles codificadas (isto é, o proteoma). Esta nova abordagem substitui a atitude reducionista de analisar os genes um a um, predominante durante as últimas décadas do século XX.

Atualmente, a análise genômica de microrganismos encontra-se em fase exponencial, uma vez que muitos genomas de bactérias tanto patogênicas quanto não-patogênicas foram seqüenciados e depositados nos bancos de dados juntamente com suas informações associadas. Essas informações possibilitam a abertura de novas linhas de pesquisa, tais como a genômica funcional e proteômica, que são mais informativas e eficientes na compreensão da biologia dos microrganismos e suas relações com o meio ambiente. Além disso, a análise comparativa de genomas bacterianos tem contribuído para a identificação de novos mecanismos adaptativos e tem permitido inferências nos aspectos evolutivos dessas formas de vida.

O primeiro organismo a ter seu genoma completamente seqüenciado foi a bactéria Haemophilus influenzae, cujo trabalho foi concluído em 1995 por um grupo do TIGR (The Institute for Genomic Research) nos Estados Unidos. A estratégia utilizada foi o seqüenciamento genômico usando fragmentos aleatórios de DNA (Whole Genome Shotgun Sequencing) (8) (9), eliminando assim, a necessidade de abordagens de mapeamento genômico. Essa estratégia de seqüenciamento associada à área de bioinformática, a qual desenvolve métodos computacionais de algoritmos que auxiliam a montagem dos genomas, multiplicou o número de genomas disponíveis nos bancos de dados nos últimos anos (10).

Em 2001, o Brasil entrou definitivamente na era genômica quando concluiu o projeto de seqüenciamento da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (11), causadora do CVC (Citrus Variegated Chlorosis), ou amarelinho, em culturas de citrus (ONSA-FAPESP). Este projeto congregou vários laboratórios dentro do estado de São Paulo, contribuindo para a formação de competência profissional e infra-estrutura na área. A este, seguiram-se outros, que igualmente contribuíram para que as pesquisas na área de genômica se expandissem em nível nacional. Atualmente, o Brasil conta com vários genomas seqüenciados e armazenados, entre eles, o genoma da bactéria Xylella fastidiosa que causa a doença de Pierce nas videiras da Califórnia (12) (AEG-FAPESP); os cosmídeos dos Projetos Genoma da Xanthomonas axonopodis pv citri (causa o Cancro Cítrico) e os da bactéria Xanthomonas campestris pv campestris (ataca as brássicas) (ONSA-FAPESP); os genomas das bactérias Chromobacterium violaceum (13; 14) e Mycoplasma synoviae (15) (Genoma Nacionall – CNPq) e Mycoplasma hyopneumoniae (15) (Rede Sul – CNPq); e as bibliotecas de clones ESTs do Genoma da cana-de-açúcar (SUCEST-FAPESP); do Eucalipto (AEG-FAPESP); do café Coffea robusta (AEG-FAPESP) e, mais recentemente, do bovino Bos indicus (AEG-FAPESP), entre outros. Em seguida aos seqüenciamentos surgiram grupos de estudos de genoma funcional com o objetivo de analisar as funções biológicas dos genes identificados e gerar benefícios potenciais nas áreas da agricultura, saúde e biotecnologia.

A vasta quantidade de dados gerados por projetos na área genômica está ocasionando uma verdadeira revolução, com grande potencial para o desenvolvimento da biologia básica e aplicada. A comunidade científica está concentrada principalmente em decifrar a informação genética contida na molécula de DNA, com o objetivo de compreender a fisiologia dessas diferentes formas de vida, criando condições para interferir nos processos biológicos em prol da agricultura e da medicina (10).

As análises comparativas iniciais das enzimas envolvidas na conservação de energia em procariotos revelaram um perfil filogenético complexo, sugerindo que a adaptação dos microrganismos a nichos especializados levou não só à perda de genes, mas também à sua aquisição. Além disso, a análise comparativa dos diferentes genomas de patógenos de plantas pode contribuir com informações importantes na elucidação de mecanismos de instalação da doença em vegetais, identificação de novos agentes envolvidos nesse processo e mecanismos específicos de interação entre patógeno-hospedeiro. No caso da bactéria Xylella fastidiosa, antes da elucidação da seqüência completa, muito pouco era conhecido do mecanismo molecular de patogenicidade da bactéria. Hoje, além dos genes relacionados com o metabolismo básico, vários genes relacionados com a patogenicidade foram identificados, alguns deles nunca anteriormente identificados em patógenos de plantas, trazendo novas inferências ao processo de patogenicidade bactéria-planta (11).

A chamada “era pós-genômica” começou com a constatação de que os dados trazidos pelo seqüenciamento das moléculas de DNA, embora relevantes, são limitados, sendo imprescindível investigar tanto os processos de transcrição das informações contidas no genoma quanto os seus produtos, as proteínas (16). Neste contexto, a estratégia tecnológica denominada DNA microarray (microchip de DNA) veio revolucionar a capacidade de coletar informação na área da genômica funcional. Após o seqüenciamento do genoma de um determinado organismo, os DNA microarrays permitem obter o perfil completo dos genes que são expressos em qualquer tipo celular desse organismo. A técnica DNA microarray consiste na hibridização com RNAs mensageiros (RNAm) em um suporte contendo milhares de seqüências de DNA imobilizadas visando a identificação específica de genes, a comparação de genomas diferentes e o monitoramento da expressão gênica (17).

Dentre as múltiplas aplicações do DNA microarray em investigação biomédica, duas apresentam grande relevância em Microbiologia: a pesquisa de novas drogas e novos métodos para diagnosticar microrganismos patogênicos. Até a última metade do século passado, a procura de novas drogas terapêuticas iniciava-se com a identificação da via bioquímica implicada num processo fisiopatológico. Uma vez identificadas as potenciais enzimas alvo, procuravam-se então pequenas moléculas com capacidade de se ligarem especificamente a essas enzimas, as quais pudessem interferir no seu funcionamento. Atualmente, com a utilização da metodologia de DNA microarray a indústria farmacêutica pode aumentar a precisão e eficácia na procura de novos potenciais alvos, bem como, validar esses alvos (isto é, demonstrar que a utilidade terapêutica está na interferência com a molécula alvo), otimizar os efeitos pretendidos e reduzir a sua toxicidade. Por outro lado, os DNA microarrays também estão revolucionando a área de Microbiologia, ao permitirem obter “impressões digitais” de agentes patogênicos ainda desconhecidos ou difíceis de cultivar no laboratório e analisar padrões de expressão em macrófagos humanos infectados com diversos agentes patogênicos, virais ou bacterianos.

O seqüenciamento do genoma humano, aliado à genômica estrutural e funcional, trouxe grande impacto na medicina, possibilitando a identificação de fatores de risco, de prognóstico e de resposta ao tratamento do câncer e a customização de terapias, permitindo a individualização dos tratamentos, com maior resolução e menor custo.

No passado, os bioquímicos destruíam as células, analisavam seus componentes, isolavam-nos para determinar sua estrutura tridimensional na busca de saber como funcionam. No futuro, com o conhecimento das partes e por meio da simulação computacional de diferentes redes de genes, complexos protéicos e vias metabólicas, será possível ter o conhecimento global de como o conjunto opera em sua dinâmica para sobreviver às variações do meio.

Estas novas metodologias e estratégias têm a vantagem de serem aplicáveis no estudo e caracterização de genes diversos, conhecidos ou não, incluindo a prospecção de alvos em genomas de organismos ainda não cultiváveis ou de difícil cultivo em laboratório. Assim, o ‘genoma’ estuda a molécula de DNA e a informação nela armazenada sob a forma de genes. A transcrição do DNA para o RNA, o primeiro passo do fluxo da informação genética, é investigada pelo estudo do ‘transcriptoma’, que dá uma idéia da funcionalidade do genoma daquela célula. As proteínas expressas são analisadas e identificadas pelo ‘proteoma’, enquanto o ‘metaboloma’ visa determinar os metabólitos, os produtos finais dos diversos processos celulares e que podem englobar, além dos nucleotídeos e aminoácidos, os açúcares, lipídios, esteróides e mais uma infinidade de outras moléculas importantes para a manutenção da atividade biológica.


Metagenômica Microbiana: acesso à biodiversidade não cultivada

Do ponto de vista histórico, microrganismos cultiváveis do solo têm sido uma fonte inestimável para a produção de compostos naturais com atividade biológica importantes para a humanidade (7). Durante os últimos 50 anos, produtos derivados de metabólitos secundários têm sido usados nas áreas médica, industrial e agrícola, como os antibióticos, drogas anti-carcinogênicas, anti-fúngicos, agentes imunossupressores, probióticos; enzimas e polímeros para aplicações industriais e tecnológicas, herbicidas, inseticidas, promotores de crescimento, entre outros. Outras enzimas microbianas são importantes para pesquisa acadêmica e desenvolvimento de aplicações biotecnológicas, incluindo as enzimas de restrição e polimerases de ácidos nucléicos, as quais são rotineiramente utilizadas na tecnologia do DNA recombinante.

Tradicionalmente, compostos com atividade biológica têm sido acessados por métodos envolvendo isolamento e cultivo dos organismos a partir das amostras ambientais, principalmente solo. Isolados e/ou produtos de fermentação passam por um processo de triagem para as atividades desejadas. A maioria das enzimas utilizadas industrialmente tem sido descoberta desta maneira. Apesar do sucesso desta abordagem, várias limitações têm sido reconhecidas ultimamente, como algumas reações de biotransformação e biocatalíticas, as quais ainda permanecem impraticáveis em função de deficiências associadas às enzimas, tais como baixa taxa de expressão ou localização intracelular. A descoberta de perfis de atividade novos freqüentemente requer novos compostos e a estratégia de cultivo parece recuperar, na sua maioria, microrganismos conhecidos.

A alta taxa de “redescoberta” de produtos naturais, principalmente metabólitos secundários, a partir de microrganismos que podem ser cultivados em laboratório nos últimos 20 anos tem levado à idéia de que esta “fonte inestimável” de produtos naturais se esgotou (18).

Por outro lado, nos últimos anos, estudos de diversidade microbiana empregando microscopia e contagem de células têm revelado que podemos recuperar apenas cerca de 1-10% dos microrganismos de uma amostra ambiental através do isolamento e cultivo (19) (20) (21). Isto se deve basicamente às limitações inerentes às técnicas de plaqueamento e cultivo, uma vez que todos os meios de cultura são seletivos em maior ou menor extensão para os diversos grupos de microrganismos e, na maioria das vezes, incapazes de reproduzir as condições encontradas no ambiente. Este é o caso de microrganismos que vivem sob a forma de consórcios, onde uma espécie depende de produtos do metabolismo de outras espécies para sua sobrevivência e multiplicação; de microrganismos simbiontes, os quais vivem no interior de outros organismos e de microrganismos extremófilos, como aqueles adaptados a condições extremas de temperatura ou pressão, por exemplo.

Portanto, os genomas da microbiota total encontrada em uma comunidade, chamados coletivamente de metagenoma (22), contêm muito mais informação genética do que aquela verificada na diversidade microbiana cultivada.

Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas foram otimizadas e adaptadas para superar as limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos microrganismos, e desencadearam uma série de estudos de ecologia microbiana que mudaram drasticamente a perspectiva da diversidade microbiana. Estes métodos envolvem a lise de células microbianas na matriz do solo, a extração dos ácidos nucléicos a partir desta matriz e a análise de seqüências-alvo nas amostras mistas de DNA de organismos diversos (metagenoma), utilizando para isso sondas ou primers grupo-específicos. Esta estratégia foi adotada como ferramenta padrão para analisar a diversidade de muitos ambientes diferentes, revelando a descoberta de novos grupos de organismos, nunca antes cultivados (21) (23) (24). Entretanto, estas metodologias não nos permitem ter acesso ao potencial metabólico destes novos organismos, uma vez que as etapas de isolamento e cultivo são suprimidas dos estudos.

Uma estratégia molecular que oferece uma alternativa para a exploração do potencial metabólico de microrganismos que não são recuperados por métodos baseados em cultivo envolve o uso de vetores do tipo BAC (Bacterial Artificial Chromosome), para clonagem de fragmentos grandes de DNA (20 a 300 kb) a partir de amostras ambientais, e análise das complexas bibliotecas metagenômicas resultantes em busca por novas atividades biológicas (22) (25) (26) (Figura 1).

Originalmente desenvolvidos para mapeamento cromossômico e análise do genoma humano, os vetores BAC podem manter de maneira estável insertos de DNA excedendo 300.000 pares de bases (27) e permitir a expressão de genes procarióticos em um hospedeiro bacteriano heterólogo (28), isto é, uma linhagem de bactéria de uma espécie diferente daquela de onde os genes foram originalmente clonados, a qual pode ter sistemas de expressão e regulação gênicas diferentes.




Figura 1. Construção de uma biblioteca metagenômica. Fragmentos grandes de DNA obtidos de microrganismos não cultivados de solo são ligados em vetores BAC e transformados em células hospedeiras de E. coli. Fonte: Osburne et al. (29). (Reproduzido com permissão da American Society for Microbiology).
Bibliotecas BAC oferecem assim uma ferramenta poderosa para acessar de maneira mais abrangente a diversidade microbiana total em um dado ambiente, permitindo a análise de genes funcionais de membros da microbiota, principalmente de microrganismos não-cultivados. Desta forma, a partir de uma biblioteca BAC de metagenoma, uma variedade maior de compostos com atividade biológica de interesse pode ser obtida simultaneamente, em comparação ao método tradicional de obtenção de compostos naturais, baseado em isolamento, cultivo e triagem de linhagens puras de microrganismos (Figura 2).



Figura 2. Comparação esquemática das estratégias de cultivo (esquerda) e metagenoma (direita) para obtenção de novos compostos com atividade biológica. Com a estratégia de cultivo, apenas uma fração da diversidade microbiana existente pode ser obtida em cultura pura. Os microrganismos não cultivados só podem ser acessados através de seus genomas. Assim, com a estratégia de metagenoma, os genomas de todos os microrganismos em um dado habitat são isolados e clonados em hospedeiros para subseqüente seleção e expressão do composto de interesse Fonte: Lorenz et al. (30). (Reproduzido com permissão da Elsevier).

A viabilização das bibliotecas metagenômicas como um método para seleção de novos compostos de interesse só é possível, no entanto, quando uma abordagem integrada é usada, combinando metodologias de triagem de alto desempenho (high-throughput) recém-desenvolvidas, como ensaios enzimáticos miniaturizados (em microplacas) associados a leitores de placa e tecnologia de hibridização em microarrays de DNA, com seqüenciamento em larga escala e a bioinformática. Esta última envolve o desenvolvimento e o emprego de bases de dados e programas de análise de seqüências de DNA e proteínas para acelerar a análise funcional e comparativa dos genes ou operons clonados.

A estratégia BAC abre, portanto, perspectivas para a descoberta de novos produtos naturais. Os genes requeridos para a biossíntese de muitos antibióticos e outros metabólitos geralmente estão agrupados, juntamente com genes para auto-resistência, e são comumente grandes e difíceis de clonar usando-se estratégias convencionais. Com a estratégia BAC é possível clonar uma via biossintética inteira em um plasmídio BAC, permitindo a captura, expressão e detecção de produtos naturais a partir de uma biblioteca construída de DNA ambiental. Ainda, a produção de tais compostos em um sistema geneticamente definido como aquele de E. coli torna a manipulação dos genes clonados mais fácil.

Rondon et al. (26) mostraram que clones BAC, obtidos utilizando DNA genômico originado diretamente de solo agrícola (metagenoma), podiam expressar várias funções biológicas em E. coli, incluindo a produção de amilases, lipases e antibacterianos. Além disso, os autores demonstraram que as seqüências que codificam para estes produtos eram novas, corroborando a hipótese de que bibliotecas BAC de DNA ambiental fornecem uma inestimável fonte de genes novos. Utilizando a mesma biblioteca BAC, Gillespie e colaboradores (31) conseguiram a expressão e o isolamento de compostos pigmentados com atividade antibiótica de amplo espectro, designados Turbomicina A e B.

A expressão e o isolamento de pequenas moléculas antimicrobianas a partir de bibliotecas de DNA do solo também foram obtidos por MacNeil et al. (32), que demonstraram a expressão de uma família de moléculas pequenas relacionadas à indirubina, uma molécula pigmentada com propriedades anti-leucêmicas.

Outros estudos de triagem de bibliotecas metagenômicas permitiram a detecção de genes de quitinase (33), 4-hidroxi butirato desidrogenase (34), lipase (35), protease (36), sintases policetônicas (37) (38) e nitrilases (39). Um amplo estudo conduzido recentemente por Voget et al. (40), combinando uma estratégia dependente de cultivo com triagem de biblioteca metagenômica e seqüenciamento, resultou na identificação de vários genes que codificam enzimas com valor biotecnológico, incluindo agarases, celulases, uma alfa-amilase, pectato liases e lipases.

Os avanços recentes obtidos na busca por atividade biológica fazem da clonagem de metagenoma e triagem dos clones resultantes para produção de compostos naturais uma tecnologia oportuna e factível. As metodologias high-throughput tornam viável o teste de milhares de clones requeridos para cobrir o metagenoma do solo. A sensibilidade dos ensaios modernos para atividade biológica, particularmente aqueles conduzidos em nanoescala, fornece um meio para identificar clones que produzem ou exportam pequenas quantidades de uma molécula ativa. Inclusive, o uso de E. coli como célula hospedeira estende o poder desta estratégia, uma vez que esta bactéria é comumente usada em fermentação industrial e, portanto, métodos sofisticados que facilitam a produção em batelada, separações, assim como o processamento downstream, já estão bem estabelecidos. Isto significa que muitos dos estágios de desenvolvimento para a produção comercial de compostos úteis já foram realizados antes dos genes serem clonados, oferecendo uma vantagem sobre os produtos naturais derivados diretamente de organismos “selvagens” que podem ser difíceis de manipular para propósitos industriais.

Os métodos desenvolvidos para a descoberta de novas vias de síntese de produtos naturais a partir de microrganismos de solo vem sendo atualmente utilizados para outros habitats, tais como a microbiota de insetos ou animais marinhos (41), os quais são tidos como uma fonte promissora de novos compostos mas freqüentemente difíceis de serem reproduzidos em laboratório.

Os primeiros esforços na construção de bibliotecas metagenômicas a partir de ambientes brasileiros, visando à bioprospecção microbiana, tiveram início recentemente no Brasil em alguns poucos grupos de pesquisa. Entretanto, ainda não foram registrados resultados concretos na obtenção de atividades biológicas ou produtos naturais com potencial para aplicação tecnológica. Alguns dos projetos atualmente em desenvolvimento na linha de metagenômica incluem um convênio firmado entre a Petrobras e o CPQBA e um projeto financiado pela Fapesp (no. Processo 04/01794-1), os quais têm como objetivos a implementação da metodologia de construção de bibliotecas metagenômicas e a subseqüente exploração da microbiota presente em amostras de lodo de efluentes de refinarias petróleo e em sedimentos impactados com hidrocarbonetos, respectivamente. A triagem destas bibliotecas metagenômicas permitirá a obtenção de clones, ou consórcios destes, que apresentem alta eficiência de degradação de um ou vários compostos aromáticos recalcitrantes e que possam ser utilizados em tratamentos complementares de efluentes de refinarias de petróleo e em processos de biorremediação de áreas contaminadas. Ainda, estes projetos propõem analisar a diversidade de genes de degradação de hidrocarbonetos ou compostos aromáticos recalcitrantes nas bibliotecas metagenômicas, contribuindo para o conhecimento sobre as vias catalíticas utilizadas na degradação de compostos do petróleo.

A bioprospecção genômica microbiana é uma estratégia inovadora na área de microbiologia do petróleo que poderá gerar tecnologia de grande impacto econômico para os setores de exploração e processamento de petróleo no país.

Uma revisão recente sobre os estado da arte da metagenômica microbiana foi elaborada por Oliveira e Manfio (42), que apontam esta abordagem como uma tecnologia de ponta altamente eficiente para a descoberta de novas enzimas para o mercado tecnológico.
Importância dos Centros de Recursos Microbianos na Biotecnologia

A biotecnologia é reconhecida como uma das mais promissoras tecnologias para o século 21, devido às suas características de inovação e impacto na busca e descoberta de recursos biológicos industrialmente exploráveis e pela importância frente a problemas globais tais como: doenças, nutrição e poluição ambiental (43).

O material biológico representa um novo insumo tanto no ambiente da pesquisa e desenvolvimento quanto nos processos produtivos, cujo tratamento requer a implementação de um sistema que permita assegurar, para todos os efeitos, que um dado material biológico mantenha as características nele identificadas ou a ele atribuídas. Neste contexto, as coleções biológicas são essenciais para o suporte ao desenvolvimento da biotecnologia, provendo insumos, material biológico certificado e informações associadas (44).

Como infra-estrutura fundamental na conservação da biodiversidade e distribuição de recursos genéticos (Figura 3), as coleções de serviço merecem atenção especial (45). A operação e o gerenciamento de coleções microbiológicas de serviço requerem capacitação técnica especializada e infra-estrutura específica, além de cuidados especiais com relação às práticas de controle de qualidade, biossegurança e autenticação de seus acervos (46). Coleções de serviço, que possuem acervos abrangentes e curadoria profissional, com sistemas de informação que permitem rastrear as condições de processamento, conformidade dos produtos e registros do material biológico distribuído, são potenciais candidatas ao status de Centro de Recursos Biológicos (CRBs), uma nova categoria proposta no cenário internacional e que contém a seguinte definição: “...são partes essenciais da infra-estrutura de apoio às ciências da vida e biotecnologia, atuando como provedores de serviços, repositórios de células vivas e genomas de organismos e informação relacionada à hereditariedade e funções de sistemas biológicos.” (definição adotada no Workshop “Biological Resource Centres”, Tokyo 1999).

Dentre as funções e serviços prestados por CRBs, destacam-se: (i) Centros de Recursos Genéticos (conservação e arquivo da diversidade biológica e variabilidade genética; provisão de insumos par a biotecnologia; distribuição de material de referência para controle de qualidade/competitividade industrial; seleção e triagem de material biológico para uso industrial; aplicações diversas nas áreas de saúde, agricultura, meio ambiente e educação), (ii) Centros de Informação (organização e provisão de dados taxonômicos e tecnológicos sobre material biológico; disponibilização da informação sobre acervo par ensino, pesquisa, inovação tecnológica, (iii) Centros de Treinamento (preservação de material biológico; bioinformática e informática para biodiversidade; biossistemática e taxonomia, assim como (iv) Centros de Serviços Especializados (caracterização taxonômica e/ou tecnológica de material biológico; controle de qualidade de material biológico e testes de desafio; depósito de material biológico inclusive para fins patentários) (47).

A procura por material biológico em coleções reconhecidas se deve principalmente ao fato de que estas coleções possuem como procedimentos de rotina a realização de testes de controle de qualidade e autenticação do material. Existem coleções microbiológicas importantes localizadas no mundo inteiro, as quais atuam como centros de excelência em conservação ex situ e taxonomia microbiana, como por exemplo: ATCC (Estados Unidos), BCCM (Bélgica), CBS (Holanda), CFBP (França), DSMZ (Alemanha), ICMP (Nova Zelândia) e JCM (Japão). No Brasil, país mega-diverso, detentor de cerca de 20% da diversidade global, o sistema existente de coleções de serviço é ainda bastante incipiente, em razão da falta de uma política adequada (45).

Entretanto, o Brasil se destaca no quadro internacional por apresentar elevada capacitação institucional quando comparado com outros países em desenvolvimento. Na área da saúde, o exemplo da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) é significativo na medida em que congrega, no Instituto Oswaldo Cruz, 11 centros de referência nacionais, 5 centros colaboradores da Organização Mundial da Saúde e 14 coleções de culturas, sendo 10 setoriais e 4 institucionais. No setor agrícola, a Coleção de Culturas de Bactérias Diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, vem contribuindo com importantes avanços relacionados com a elucidação dos mecanismos de fixação biológica de nitrogênio e aplicações tecnológicas. Ainda, a Coleção de Culturas de Fitobactérias do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do Instituto Biológico de São Paulo mantém um acervo que constitui a maior fonte de linhagens bacterianas fitopatogênicas oriundas de áreas tropicais (48). A Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI), estabelecida no CPQBA em 2002, com o respaldo institucional da Universidade Estadual de Campinas (uNICAMP), foi estruturada para atuar como uma Coleção de Serviço, visando atender à demanda da comunidade acadêmica e industrial, oferecendo serviços especializados para o setor.

Atualmente, existe no cenário internacional um conjunto de ameaças concretas ao trânsito de material biológico e, portanto, a devida preservação e fornecimento de material biológico certificado por Coleções de Serviço e/ou Centros de Recursos Biológicos é de grande relevância para o desenvolvimento biotecnológico em nosso país.



Figura 3. A bactéria Chromobacterium violaceum CBMAI 534 produtora de violaceína com propriedades farmacológicas (à esquerda) e o fungo filamentos Beauveria felina CBMAI 739 produtor de destruxinas com potencial aplicação no controle biológico de insetos (à direita).

Referências bibliográficas

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Endereço para correspondência

Divisão de Recursos Microbianos

Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA)

Universidade Estadual de Campinas

Caixa Postal 6171, CEP: 13081-970, Campinas, SP.

E-mail: vmaia@cpqba.unicamp.br; lara@cpqba.unicamp.br e fabianaf@cpqba.unicamp.br



Data de Recebimento: 04/07/2006

Data de Aprovação: 11/09/2006






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