Química organica



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TECNOLOGIA DNA-REC
3º ANO (2006-2007)

E.B.

Prof. responsável: Alfredo Cravador

SUMÁRIOS


1ª aula (2 h), 13 de Março 2007

Apresentação. Programa. Bibliografia. Conhecimentos pressupostos como adquiridos para abordar a disciplina.


Tecnologia de DNA recombinante: I- Os instrumentos de base, 1a- As enzimas, suas actividades e utilizações. Endonucleases de restrição e metilases. Estabelecimento de uma carta de restrição. Actividades e uso das enzimas: DNase I, ribonuclease A, Exonuclease III, DNA polimerase, fragmento de Klenow da polimerase I (grande fragmento da DNA polimerase I).

2ª aula (2 h), 15 de Março 2007

Enzimas, actividades e utilizações (cont.): Exonuclease III, Bal 31; nuclease S1, T4 polinucleotídeo cinase (marcação do DNA na extremidades 5'), fosfatase alcalina, terminal desoxirribonucleotidiltransferase (terminal transferase), transcritase reversa e RNase H.



Vectores de clonagem. a) Plasmídeos: tipos, características, estrutura geral, concepção dum vector plasmídico. Ex. pBR322, pUC19. Marcadores genéticos utilizados na selecção de transformantes: resistência a antibióticos, sistemas baseados na regulação do Lac Z.
3ª aula (2 h), 19 de Março 2007

Vectores de clonagem (cont.): Sistemas de selecção baseados na regulação do Lac Z (cont.) e no cell-killing gene. Vectores de clonagem vai-vem (Shuttle). Vectores derivados do bacteriófago λ. Descrição do ciclo lítico subsequente ao processo infeccioso em E. coli. Descrição das características do genoma de λ. Descrição do empacotamento in vitro; Vantagens do sistema de clonagem recorrendo a λ. Cosmídeos. Descrição do sistema de clonagem e discussão das vantagens. Vectores derivados de bacteriófago M13 .Descrição do sistema de replicação de M13 e da clonagem neste vector. Sistemas de vectores de elevada capacidade: BAC's bacterial artificial chromosoma's e P1 derived artificial chromosoma.

Sequenciação de DNA. Método químico de Maxam & Gilbert. Preparação dos fragmentos, sua marcação radioactiva e separação. Princípio do método. Reacções de modificação específica e de clivagem. Análise dos fragmentos.

Método de Sanger, ou didesoxi, ou terminação de cadeia. Princípio do método. Análise dos fragmentos.
4ª aula (2 h), 20 de Março 2007

Método de sequenciação de Sanger (contin.). Sequenciação automática. Princípio e características. Utilização de grupos químicos fluorescentes associados aos ddNTPs ou aos primers de iniciação. 1 pista-4 cores, ou 4 pistas-1 cor. Utilização do bacteriófago M13 em sequenciação pelo método de Sanger. Recurso ao sistema de regulação do lacZ como controlo de fagos recombinantes. Primer walking. Limitações do M13 em sequenciação. Sequenciação a partir de DNA bicatenário (ex., em plasmídeos). Sequenciação baseada na PCR.



Síntese química de DNA (oligonucleotídeos). Aplicações dos fragmentos sintéticos de DNA (oligonucleotídeos). Princípio da síntese a partir dos 4 desoxinucleosídeos de base. Métodos do fosfatotriéster e do fosforamidito. Síntese dos blocos de base inteiramente protegidos. 1. Protecção selectiva dos grupos NH2 exocíclicos. 1.a. Protecção transitória dos grupos hidroxílicos. 1b protecção permanente das bases. 1.c. Remoção selectiva da protecção dos grupos OH. 2. Protecção transitória selectiva do grupo 5’ OH. 3. Fosforilação do grupo 3’OH. 3a. Fosfato triéster. Introdução de grupos de protecção permanente e transitória do fosfato. 3b. Fosforamidito. Grupos de protecção permanente e transitória. 4. Desprotecção selectiva. 5. Formação da ligação internucleotídica (condensação) pelos métodos do fosfato triéster e do fosforamidito.
5ª aula (2 h), 22de Março 2007

6. Extensão da cadeia oligodesoxinucleotídica; 6a Fosfato triéster e 6b fosforamidito. Síntese em fase homogénea (líquida) e em fase sólida. 6c. Ligação a um suporte sólido insolúvel. Princípio da síntese de Merrifield (em fase sólida). Síntese automatizada. Descrição de um ciclo de extensão da cadeia oligonucleotídica. Cálculo do rendimento final. 7. Desprotecção final e clivagem. 8. Purificação.



Síntese de genes. Exemplo da utilização da síntese química na síntese do gene (síntese de fragmentos complementada com ligação pela ligase) que codifica o GRF (factor de libertação da hormona de crescimento ou GHRH) e na construção dum vector de expressão contendo um promotor forte. Utilização da PCR na síntese de genes: síntese química conjugada com síntese enzimática (polimerase).

Métodos de transformação bacteriana: preparação de células competentes, utilização de CaCl2. Electroporação.

6ª aula (2 h), 26 de Março 2007

Construção e escrutínio (screening) dum banco de genes/clones: a) gene de procariota. Digestão parcial do DNA total. Construção e screening de bancos genómicos. Número mínimo de clones necessários para ter a representação da globalidade dum genoma: em função da complexidade do genoma, do tamanho do inserto, da probabilidade de encontrar um gene específico na colecção de clones. Identificação da sequência alvo/detecção de clones. Hibridação com sondas de DNA Preparação de sondas de DNA. Marcação a) radioisotópica e screening por autorradiografia e fluorografia.b) com base na Biotina ou c) na Digoxigenina. Uso de sondas oligonucleotídicas sintéticas. Estratégias para a sua concepção. Métodos de screening de bancos genómicos. Screening por hibridação com DNA. Screening por ensaio imunológico. Screening pela actividade da proteína (enzima). Screening por complementação genética funcional. Clonagem de sequências de DNA que codificam proteínas de eucariotas. Isolamento do mRNA.



7ª aula (2 h), 27 de Março 2007

Mutagénese dirigida: objectivos e métodos. a) Utilização de oligonucleótidos e do M13. Utilização da estirpe bacteriana deficiente dut ung; b) utilização de plasmídeos. Utilização da PCR e de plasmídeos. Mutagénese ao acaso - primers oligonucleótidos degenerados (preparação e uso). Incorporação de oligonucleótidos degenerados. Mutagénese ao acaso com análogos de nucleótidos. Mutagénese por PCR susceptível de fazer erros. Arquitectar novas proteínas a partir de recombinações de DNA de genes homólogos codificando proteínas nativas com actividades semelhantes (ex. interferões e hormona de crescimento humanos). Produção de proteínas mutantes contendo amino ácidos não naturais.



8ª aula (2 h), 29 de Março 2007

Sistemas de expressão: organismos hospedeiros-vectores. Os sinais moleculares em procariotas de controlo da transcrição. Exemplo de unidade de transcrição bacteriana. Vectores de expressão especializados (E. coli). Elementos genéticos de controlo (transcrição, tradução, estabilidade e secreção da proteína). Características biológicas moleculares manipuladas para modular a expressão genética: sequências promotoras e terminadoras, eficácia do local de ligação do ribossoma, número de cópias do gene clonado, expessão do gene a partir dum plasmídeo ou integrado no genoma do hospedeiro, localização celular final da proteína estrangeira, eficácia da tradução no organismo hospedeiro, estabilidade intrínseca da proteína produzida pelo gene clonado dentro da célula hospedeira. Exemplos de sistemas de regulação de transcrição: regulação negativa (indução de estado on e de estado off); regulação positiva Expressão de genes em E. coli a partir de promotores fortes e reguláveis: lac, trp, tac, trc, lpp, PL de , promotor do gene 10 do bacteriofago T7. Descrição de cada um dos sistemas.

Uso de sistema binário de vectores para controlar o ratio ideal número de cópias de sequências promotoras-gene de interesse/nº de cópias de sequências codificantes de moléculas repressoras. Exemplo de construção de vector (pCP3) com o objectivo de aumentar a produção de proteína. Problemática dos sistemas de produção a escala piloto e industrial e exemplo de soluções (sistema binário de vectores recorrendo ao uso dos promotores trp e pL). Proteínas de fusão: estratégias para a sua síntese, finalidades e aplicações.



As limitações da produção de proteínas no meio citoplasmático bacteriano.

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