SoluçÕes parenterais de grande volume



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V M: Volume mínimo de cada meio.

A: Volume mínimo tomado de cada recipiente por cada meio.


L-4.4.1. Equipamento
Uma unidade de filtração por membrana adequada consiste em um equipamento que facilita o manuseio asséptico dos produtos a analisar e que permite retirar a membrana processada assepticamente para a inoculação no meio adequado ou um equipamento onde possam acrescentar-se meios estéreis ao filtro e incubar a membrana in situ.
Uma membrana geralmente aceita para o teste de esterilidade tem uma porosidade nominal de 0.45 +/-0.02 um, um diâmetro de aproximadamente 47 mm e uma velocidade de fluxo de 55 a 75 ml de água por minuto a uma pressão de 70 cm de mercúrio.
A unidade completa pode armar-se e esterilizar-se com a(s) membrana(s) em seu lugar antes de ser(serem) usada(s) no ensaio, ou pode-se esterilizar as membranas separadamente por qualquer modo que mantenha as características de comportamento do filtro e assegure a esterilidade do filtro e do equipamento.
L-4.4.2. Procedimento
Transferir assepticamente os volumes requeridos para ambos os meios, como se indica na tabela de quantidades, seja diretamente em um ou dois equipamentos de filtração por membrana separados, ou em um recipiente estéril para fazer um pool antes de transferi-los.
Se o volume de líquido é de 100 ml até 500 ml, transferir assepticamente o conteúdo completo de não menos de 10 recipientes através de cada um dos equipamentos de filtros, ou não menos do que 20 recipientes se for usado um único equipamento de filtro. Se o volume do líquido no produto for de mais de 500 ml, transferir assepticamente não menos de 500 ml, de cada um de não menos que 10 recipientes, através de cada um dos equipamentos, ou não menos que 20 recipientes se for usado um único equipamento de filtro. Passar imediatamente cada amostra através do filtro com a ajuda de vácuo ou pressão.
Em alguns casos, quando o líquido é altamente viscoso ou não pode ser rapidamente filtrado através de uma ou duas membranas, podem ser necessários mais que dois equipamentos de filtros; nesses casos, a metade do número de membranas usadas se incubam em cada meio, respeitando-se os volumes e requerimentos para o número de recipientes por meio.
Se o produto é bacteriostático ou fungistático, enxaguar a(s) membrana(s) com três porções de 100 ml de Líquido de Lavagem A.
Nota: Líquido de Lavagem A.
Dissolver 1 g de Digesto Péptico de Tecido Animal (Peptona Bacteriológica) em quantidade suficiente de água para alcançar 1 litro, clarificar por filtração ou centrifugação e ajustar o pH a 7.1 +/- 0.2. Fracionar em quantidades de 100 mL e esterilizar por vapor.
Retirar assepticamente a(s) membrana(s) do(s) suporte(s), cortar a membrana pela metade (se for usada uma só membrana), submergi-la, ou sua metade em 100 ml de Meio de Digesto de Semente de Soja-Caseína, e incubar entre 20° e 25° durante pelo menos 7 dias. Similarmente, submergir a outra membrana, ou a outra metade, em 100 mL de Meio Fluido de Tioglicolato, e incubar entre 30° e 35° durante pelo menos 7 dias.
L-4.5. Interpretação dos resultados
L-4.5.1. Primeiro Passo
Nos intervalos indicados durante e após o período de incubação, examinar o conteúdo de todos os recipientes para observar o crescimento microbiano, assim como o desenvolvimento de turvação e/ou crescimento de superfície. Se não se observa crescimento, o produto analisado cumpre os requerimentos do ensaio de esterilidade.
Se for observado crescimento, mas a revisão do lugar onde foi realizado o ensaio de esterilidade, dos materiais usados, dos procedimentos de ensaio e dos controles negativos, indicar que pôde ter sido usada uma técnica inadequada ou houve um mal manejo asséptico no ensaio propriamente dito, o Primeiro Passo é declarado não válido e deve ser repetido.
Se for observado crescimento microbiano mas não houver evidência que invalide o Primeiro Passo do ensaio, deve-se proceder ao Segundo Passo.
L-4.5.2. Segundo Passo
O número mínimo de amostras escolhidas é o dobro do número analisado no Primeiro Passo. Os volumes mínimos analisados de cada amostra e os meios e períodos de incubação são os mesmos que os indicados para o Primeiro Passo. Se não for observado crescimento microbiano, o produto analisado cumpre os requerimentos do ensaio de esterilidade. Se, ao contrário, for observado crescimento microbiano, o resultado assim obtido conclui que o produto analisado não cumpre os requerimentos do ensaio de esterilidade.
No entanto, se pode ser demonstrado que o Segundo Passo foi invalidado devido a uma técnica asséptica defeituosa ou inadequada na realização do ensaio, o Segundo Passo pode ser repetido.
Nota: Sempre que houver crescimento microbiano, proceder-se-á a seu isolamento e identificação. No caso de que o mesmo microorganismo seja encontrado em mais de um ensaio, sem importar o passo da análise, será considerado que o produto analisado não cumpre os requerimentos do Ensaio de Esterilidade.
L-5. ENSAIOS DE REATIVIDADE BIOLÓGICA
A seguir são estabelecidos dois tipos de ensaios de reatividade biológica: "in vitro" e "in vivo".
O cumprimento do ensaio "in vitro" exime da realização do ensaio "in vivo". Poderá omitir-se a realização do primeiro, efetuando-se somente o ensaio "in vivo".
L-5.1. Ensaio de reatividade biológica "in vitro"
L-5.1.1. Condições gerais
O seguinte ensaio se emprega para determinar a reatividade biológica dos cultivos de células de mamíferos depois do contato com plásticos elastoméricos e outros materiais poliméricos.
É essencial dispor da superfície específica para a extração.
Quando a superfície da amostra não possa ser determinada, utilizar 0,1 g de elastômero ou 0,2g de material plástico ou outro material, por cada mL de líquido de extração.
Também é essencial ter cuidado na preparação das amostras, para evitar a contaminação com microorganismos ou outros materiais estranhos.
L-5.1.2. Standards de referência
Standard de referência para controles negativos de plásticos de USP.

Standard de referência de sólidos de biorreação positiva USP.

Standard de referência de extratos de biorreação positiva USP.
L-5.1.3. Preparação do cultivo celular
Preparar múltiplos cultivos de fibroblastos de mamífero L-929 *linha celular ATCC CCL 1, Clon NCTC 929) em meio essencial mínimo suplementado com soro, com uma densidade de plantio de aproximadamente 10 células por mL. Incubar os cultivos a 37°C +/- 1°C durante não menos que 24 horas em uma atmosfera de 5 +/- 1% de dióxido de carbono no ar, até obter uma monocamada, com uma confluência maior do que 80%.
Examinar os cultivos preparados em microscópio para assegurar monocamadas uniformes, quase confluentes.
(NOTA: a reprodutibilidade dos ensaios de reatividade biológica "in vitro" depende da obtenção de uma densidade de cultivo uniforme).

L-5.1.4. Solventes de extração

Usar solução injetável de cloreto de sódio a 0.9%. Também podem ser utilizados meios de cultivo de células de mamífero sem soro, ou meios de cultivo de células de mamífero suplementados com soro. Usa-se meio suplementado com soro quando a extração se realiza a 37°C durante 24 horas.


L-5.1.5. Aparelhos
Autoclave. Empregar uma autoclave capaz de manter uma temperatura de 121°C +/- 2°C, equipada com um termômetro, um manômetro, uma purga, uma bandeja adequada para acomodar os recipientes de teste acima do nível da água, e um sistema de esfriamento de água que permitirá esfriar os recipientes de ensaio até uma temperatura aproximada de 20°C, mas não abaixo dessa temperatura, imediatamente depois do ciclo de aquecimento.
Estufa. Utilizar uma estufa (preferivelmente um modelo de convecção mecânica) que manterá as temperaturas de operação entre 50°C e 70°C, dentro de+/- 2°C.
Estufa de cultivo. Utilizar uma estufa de cultivo capaz de manter uma temperatura de 37°C+/- 1°C e uma atmosfera de 5 +/- 1% de dióxido de carbono no ar.
Nota: Se forem utilizados tubos com tampa, não é necessário manter uma atmosfera de dióxido de carbono na estufa do cultivo.
Recipientes de extração
Utilizar somente recipientes como ampolas ou tubos de cultivo com tampa de rosca ou equivalente, de vidro Tipo I. Se forem usados tubos de cultivo ou seu equivalente, estes devem ser fechados com tampa de rosca com uma cobertura elastomérica adequada. A superfície exposta da cobertura elastomérica deve estar totalmente protegida com um disco sólido inerte de 50 a 75 um de espessura. Pode fabricar-se um disco adequado a partir de politetrafluoretileno.
Preparação do aparelho
Limpar cuidadosamente todo o material de vidro com uma mistura sulfocrômica e, se necessário, com ácido nítrico quente, seguido de um enxágüe prolongado com água estéril para injetáveis. Esterilizar os recipientes e equipamentos utilizados para a extração, transferência ou administração do material de teste e secá-los por um processo adequado. Se for usado óxido de etileno como agente esterilizante, deixá-los pelo menos 48 horas para uma desgaseificação completa.
L-5.1.6. Procedimento
Preparação da amostra para os extratos
Seguir o procedimento indicado no ponto L-5.2.2. Preparação da amostra.
Preparação dos extratos
Seguir o procedimento indicado no ponto L-5.2.2.3 Preparação do extrato, usando uma solução injetável de cloreto de sódio a 0.9% ou meio de cultura de células de mamífero sem soro como solventes de extração.
Nota: se a extração for realizada a 37°C durante 24 horas em uma estufa de cultivo, usar o meio de cultura celular suplementado com soro.
L-5.1.7. Ensaio de difusão em ágar
Neste ensaio, a camada de ágar atua como um apoio para proteger as células do dano mecânico, ao passo que permite a difusão de produtos químicos extraíveis das amostras poliméricas. Os extratos de materiais que devem ser analisados, aplicam-se a um pedaço de papel de filtro.
L-5.1.7.1. Preparação da amostra
Usar extratos preparados de forma direta ou usar porções das amostras de ensaio que tenham superfícies achatadas de não menos de 100 mm2 de superfície.
L-5.1.7.2. Procedimento
Preparar as monocamadas em placas de 60 mm de diâmetro usanto 7 mL de Preparação de cultura celular. Aspirar o meio de cultura das monocamadas e substituir por meio de cultura suplementado com soro contendo não mais do que 2% de ágar.
Colocar as superfícies achatadas da Preparação da amostra, Controle de plásticos negativo USP (para ter um controle negativo), e um Extrato de Biorreação Positiva USP ou um Sólido Biorreação Positiva USP (para ter um controle positivo) em culturas duplicadas em contato com a superfície de ágar solidificada. Incubar todas as culturas durante ao menos 24 horas a 37°C +/- 1°C, preferivelmente em uma estufa de cultura umidificada contendo 5+/- 1% de dióxido de carbono. Examinar em cada cultura a reatividade ao redor de cada Amostra, Controle Negativo e Controle Positivo, em microscópio, usando corantes citoquímicos, se for necessário.
L-5.1.8. Interpretação dos resultados
A reatividade biológica (degeneração e má-formação celular) se descreve e qualifica em uma escala de 0 a 4 (ver Tabela 1). Medir as respostas obtidas no Controle Negativo e no Controle Positivo: o ensaio é válido se a resposta observada nos standards de referência corresponder ao grau de reatividade biológica assinalado em cada um deles.
Medir a resposta obtida da Preparação da Amostra.
A Amostra cumpre os requerimentos do ensaio se em nenhuma das culturas de células expostas à Amostra for observada nada mais do que uma reatividade leve (Grau 2).
Repetir o ensaio se não se confirmar sua validez.
TABELA 1

GRAUS DE REATIVIDADE PARA O ENSAIO DE DIFUSÃO EM ÁGAR
Grau

Reatividade

Descrição da zona de Reatividade

0

Nenhuma

Não há zona detectável ao redor ou embaixo da amostra.

1

Fraca

Zona limitada à área embaixo da amostra.

2

Leve

Zona que se estende menos de 0,5 cm além da amostra.

3

Moderada

Zona que se estende de 0,5 a 1,0 cm além da amostra.

4

Severa

Zona que se estende mais de 1,0 cm a partir da amostra, mas que não inclui o disco completo.


L-5.2. Ensaio de reatividade "in vivo"
L-5.2.1. Condições gerais
Os seguintes ensaios são empregados para determinar a resposta biológica de animais frente a materiais plásticos e outros materiais poliméricos utilizados nos recipientes das SPGV através da injeção de extratos preparados a partir do material sob ensaio.
L-5.2.2. Preparação da amostra
L-5.2.2.1. Quantidade de amostra


Espessura do material plástico (mm)

Quantidade de amostra para cada 20 mL de solução extrativa

Subdivisão (mm)

<0,5

120 cm2 de superfície total (combinadas ambas as faces)

50 x 3

0,5 a 1

60 cm2 de superfície total (combinadas ambas as faces)

50 x 3


L-5.2.2.2. Soluções extrativas
Solução fisiológica para injeção
Solução: 1:20 de álcool em solução fisiológica para injeção.

L-5.2.2.3. Preparação do extrato
Colocar a amostra subdividida em um frasco de vidro limpo e estéril de 100 mL de capacidade. Lavar duas vezes com aproximadamente 70 mL de água para injetáveis, agitando por 30 segundos em cada lavagem e eliminando completamente a água de lavagem. Adicionar ao frasco de vidro que contém a amostra, 20 mL de solução extrativa. Paralelamente, preparar um controle negativo do mesmo modo, sem a amostra sob ensaio. Para cada solução extrativa requerida no ensaio, preparar um extrato com a amostra sob ensaio e um extrato controle negativo. Realizar a extração por aquecimento em autoclave a 121°C durante 60 minutos ou em estufa a 70°C durante 24 horas, ou a 50°C durante 72 horas. As condições de extração não devem causar alterações físicas como fusão ou aglutinamento dos pedaços do material plástico, porque isto provocaria uma redução da área superficial. Uma leve aderência pode ser tolerada. Esfriar à temperatura ambiente, não inferior a 22°C. Agitar vigorosamente por alguns minutos e transferir imediatamente cada extrato a um recipiente seco e estéril de forma asséptica. Armazenar os extratos a uma temperatura entre 22 e 30°C, e utilizá-los no máximo dentro do período de 24 horas.
L-5.2.3. Ensaio de injeção sistêmica intravenosa
L-5.2.3.1. Procedimento
Utilizar camundongos albinos sadios, não utilizados anteriormente em ensaios, e com peso entre 17 e 23 g. Para cada grupo de ensaios utilizar camundongos de uma mesma origem. Abastecer com água e alimentos apropriados para cobaias de laboratório.
Inocular cada extrato e seu correspondente controle negativo em cada grupo de 5 camundongos, nas quantidades e vias de administração que se detalham a seguir:


Solução extrativa

Dose/quilo de peso corporal

via

Velocidade de inoculação (mL/seg)

Solução fisiológica

50 mL

EV

0,1

Solução 1:20 de álcool em solução fisiológica

50 mL

EV

0,1

Nota: EV = Endovenosa
L-5.2.3.2. Interpretação
Depois da inoculação, observar os animais às 4, 24, 48 e 72 horas. Se durante o período de observação nenhum dos animais inoculados com o extrato da amostra apresentar um grau de reação maior que os animais inoculados com o extrato controle, a amostra será considerada satisfatória no que diz respeito a este ensaio.
Se algum animal injetado com o extrato da amostra apresentar um leve sinal de toxicidad, e não mais de um animal apresentar sintomas graves de toxicidade ou morte, repetir o ensaio utilizando grupos de 10 camundongos cada um.
Depois de repetir o ensaio, a amostra será considerada satisfatória se nenhum dos animais injetados com o extrato da amostra apresentar um grau de reação maior que o observado nos animais injetados com o extrato controle.
L-5.2.4. Ensaio intracutâneo
L-5.2.4.1. Procedimento
Utilizar coelhos albinos sadios, de pele sensível e não utilizados em ensaios anteriores. O pêlo dos coelhos deve ser cuidadosamente raspado no dia do ensaio, em ambos os lados da coluna vertebral, e su pele deve estar livre de irritações ou traumatismos.
Remover os pêlos soltos por meio de aspiração e, se necessário, limpar a pele com um cotonete de algodão embebido com álcool diluído a 70%, e deixar secar antes de iniciar a inoculação.
Agitar vigorosamente cada extrato armazenado segundo o descrito na seção L-5.5.1. antes de preparar a dose para ser inoculada.
Inocular por via intradérmica, 0.2 ml de extrato da amostra em cada um dos dez pontos de inoculação de um lado da coluna vertebral, em dois coelhos. Da mesma forma, injetar 0.2 ml do extrato controle correspondente em 5 pontos do outro lado da coluna vertebral desses mesmos dois coelhos.
L-5.2.5.2. Interpretação
Examinar os locais inoculados 24, 48 e 72 horas após a inoculação para comprovar a presença de uma reação do tecido tal como eritema, edema ou necrose. Evitar tocar os pontos de inoculação durante o manuseio ou a observação do animal.
Para facilitar a observação, passar somente um algodão embebido com álcool diluído a 70% sobre a pele do animal.
Classificam-se as reações do extrato da amostra em relação ao extrato controle, de acordo à seguinte escala numérica:
Avaliações das reações da pele


Formação de eritema ou crosta

Valor

Ausência de eritema

0

ligeiro eritema quase imperceptível

1

eritema bem definido

2

eritema moderado ou severo

3

eritema severo (com ligeira crosta)

4

Formação de edema

Valor

ausência de edema

0

edema quase imperceptível

1

edema ligeiro con bordas bem definidas

2

edema moderado (elevado aproximadamente 1 mm)

3

edema severo (elevado mais de 1 mm, estendendo-se além da área de inoculação)

4







O resultado médio do extrato da amostra não deve ser maior que o resultado médio do extrato controle. Caso a média seja superior ou igual, repetir o ensaio. Usar extrato recente em outros três animais.
O critério de aceitação é o mesmo.
L-6. ENSAIO DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA
L-6.1. Considerações gerais
Este ensaio se utiliza para determinar o número total de microorganismos e/ou a presença de microorganismos indesejáveis em produtos não estéreis.
L-6.2. Contagem total de microorganismos aeróbicos viáveis
Determinar a contagem total de aeróbicos viáveis pelo método de filtração por membrana, pelo método de contagem em placa, ou pelo método de diluição seriada, segundo for determinado.
Realizar a determinação sob condições desenhadas para evitar a contaminação acidental do produto a ser examinado. As precauções tomadas para evitar a contaminação devem ser tais que não afetem nenhum microorganismo que deva revelar-se no ensaio.
A menos que seja estabelecido de outra forma, usar 10g ou 10 ml do produto a ser examinado, tomados com as precauções anteriormente referidas. Para obter a quantidade requerida, misturar várias porções escolhidas aleatoriamente, a partir do material a granel ou do conteúdo de um número suficiente de recipientes. Dependendo da natureza do produto em exame, diluir, dissolver, suspender ou emulsionar usando um líquido adequado. Eliminar qualquer propriedade antimicrobiana do produto a ser examinado por diluição, neutralização ou filtração.
Devem utilizar-se graus adequados de diluição para que o número de unidades formadoras de colônias esteja dentro dos limites sugeridos para o método a ser utilizado.


L-6.2.1. Preparação do produto
Produtos solúveis em água
Dissolver ou diluir 10 g ou 10 ml do produto a ser examinado em solução buffer cloreto de sódio-peptona pH 7.0 (L-6.4.1.) ou outro líquido adequado que demonstre não possuir atividade antimicrobiana nas condições do teste, e ajustar o volume a 100 ml(2) com o mesmo líquido. Se for necessário, ajustar a aproximadamente pH 7.
(2) As características de alguns produtos podem requerer o uso de maiores volumes.
Produtos não graxos insolúveis em água
Suspender 10g ou 10 ml do produto a ser examinado em solução buffer cloreto de sódio-peptona pH 7.0 ou outro líquido adequado que tenha demonstrado não possuir nenhuma atividade antimicrobiana nas condições do ensaio e diluir a 100 ml (2) com o mesmo líquido; se for necessário, dividir o produto a ser examinado e homogeneizar a suspensão mecanicamente. Pode-se agregar um agente tensioativo adequado como 0.1 por cento m/V de polissorbato 80 para ajudar a suspensão de substâncias com pobre umectação. Caso necessário, ajustar a suspensão para aproximadamente pH 7.
Produtos graxos
Homogeneizar 10g ou 10 ml do produto sob exame com 5 g de polissorbato 20 ou polissorbato 80, aquecido a não mais de 40°C (1) se for necessário. Misturar cuidadosamente mantendo a temperatura em um banho de água ou num forno. Adicionar 85 ml de solução buffer cloreto de sódio-peptona pH 7.0, aquecida a não mais de 40°C, se for necessário. Manter esta temperatura pelo tempo mais curto necessário para a formação de uma emulsão e em qualquer caso durante não mais do que 30 minutos. Se houver necessidade, ajustar a emulsão para aproximadamente pH 7.


  1. Para alguns produtos, pode ser necessário aquecer a não mais de 45°C durante o menor tempo possível.


L-6.2.2. Procedimento para o ensaio
L-6.2.2.1. Filtração por membrana
Usar membranas filtrantes que tenham um tamanho de poro nominal não maior que 0,45 um e cuja efetividade para reter bactérias tenha sido estabelecida. Os filtros de nitrato de celulose, por exemplo, são usados para soluções aquosas, oleosas e levemente alcoólicas, e os filtros de acetato de celulose, por exemplo, para soluções altamente alcoólicas.
O método que se descreve considera que se usam membranas de aproximadamente 50 mm de diâmetro. Se são usados filtros de um diâmetro diferente, os volumes das diluições e da lavagem devem ajustar-se conforme couber. O aparelho de filtração e a membrana devem ser esterilizados por meios apropriados. O aparelho deve ser desenhado de forma que a solução a ser examinada possa ser introduzida e filtrada sob condições assépticas e deve permitir a remoção da membrana para logo transferi-la ao meio de cultura. Transferir 10 ml, ou a quantidade de cada solução representando 1g do produto a examinar a cada uma das membranas filtrantes e filtrar imediatamente. Caso necessário, diluir o produto preparado de modo que possa esperar-se uma contagem de colônias entre 10 e 100. Lavar cada membrana passando através do filtro pelo menos três porções, cada uma de aproximadamente 100 ml, de um líquido adequado como solução buffer de cloreto de sódio-peptona pH 7.0. Para substâncias graxas, este líquido pode conter um agente tensioativo, como polissorbato 20 ou polissorbato 80. Transferir uma das membranas filtrantes, destinada principalmente para a enumeração das bactérias, à superfície de uma placa de ágar B e a outra, destinada principalmente para a enumeração de fungos, à superfície de uma placa de ágar C. Incubar a placa de ágar B a 30°C - 35°C durante 5 dias e a placa de ágar C a 20°C - 25°C durante 5 dias, a menos que se obtenha uma contagem mais confiável em um menor período de tempo. Contar o número de colônias que se desenvolvem. Calcular o número de microorganismos por grama ou por mililitro do produto a examinar, se for necessário contar as bactérias e fungos separadamente.
L-6.2.2.2. Contagem em placa
Para Bactérias
Usando placas de Petri de 9 cm a 10 cm de diâmetro, adicionar a cada placa uma mistura de 1ml do produto já preparado para seu exame em a) e aproximadamente 15 ml de ágar B fundido, a não mais de 45°C. Como opção alternativa, distribuir o produto preparado sobre a superfície do meio solidificado em uma placa de Petri do mesmo diâmetro. Se for necessário, diluir o produto preparado como foi descrito antes para que possa esperar-se uma contagem de colônias que não supere 300. Preparar pelo menos duas destas placas de Petri usando a mesma diluição e incubar a 30°C - 35°C durante 5 dias, a menos que se obtenha uma contagem mais confiável em um período de tempo mais curto. Contar o número de colônias que se desenvolvem. Calcular os resultados usando placas com o maior número de colônias, mas considerando 300 colônias por placa como o máximo concordante com uma boa avaliação.
Para fungos
Usando placas de Petri de 9 cm a 10 cm de diâmetro, adicionar a cada placa uma mistura de 1 ml do produto já preparado para seu exame em a) e aproximadamente 15 ml de ágar C fundido, a não mais de 45°C. Como opção alternativa, distribuir o produto separado sobre a superfície do meio solidificado em uma placa de Petri do mesmo diâmetro. Se for necessário, diluir o produto preparado como foi descrito anteriormente para que possa esperar-se uma contagem de colônias que não supere 100. Preparar ao menos duas dessas placas, usando a mesma diluição e incubar a 20°C - 25°C durante 5 dias, a menos que se obtenha uma contagem mais confiável em um menor período de tempo. Contar as colônias que se desenvolvem. Calcular os resultados usando placas com não mais do que 100 colônias.
L-6.2.2.3. Diluição seriada
Preparar uma série de 12 tubos cada um contendo entre 9 ml e 10 ml de cálcio A. A cada um dos primeiros três tubos, adicionar 1 ml do produto diluído, dissolvido ou homogeneizado na proporção 1 em 10, como descrito anteriormente. Aos três tubos seguintes, agregar 1 ml de uma diluição 1 em100 do produto, e aos seguintes três tubos adicionar 1 ml de uma diluição 1 em 1000 do produto. Aos últimos três tubos, adicionar 1 ml do diluente. Incubar os tubos a 30°C - 35°C pelo menos durante 5 dias. Os últimos três tubos não devem mostrar crescimento microbiano. Se a leitura dos resultados for difícil ou incerta devido à natureza do produto a examinar, subcultivar em um meio líquido ou sólido e ler os resultados depois de outro período de incubação. Determinar o número mais provável de microorganismos por grama ou por mililitro do produto a examinar a partir da Tabela I.
TABELA I

Número mais provável de microorganismos

Número de tubos onde se vê crescimento microbiano para cada quantidade de produtos a examinar

Número mais provável de microorganismos por grama ou por mililitro

100 mg ou 0.1 mL por tubo

10 mg ou 0.01 mL por tubo

1 mg ou 0.001 mL por tubo




3

3

3

maior que 1100

3

3

2

1100

3

3

1

500

3

3

0

200

3

2

3

290

3

2

2

210

3

2

1

150

3

2

0

90

3

1

3

160

3

1

2

120

3

1

1

70

3

1

0

40

3

0

3

95

3

0

2

60

3

0

1

40

3

0

0

23


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