Unesp -universidade estadual paulista “JÚlio de mesquitq filho”



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UNESP -UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITQ FILHO”

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ILHA SOLTEIRA

CAMPUS DE ILHA SOLTEIRA

ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA, TECNOLOGIA DE ALIMENTOS E SÓCIO-ECONOMIA

FIT0848 – MICROBIOLOGIA ZOOTÉCNICA

Profª. Drª. Heloiza Ferreira Alves do Prado

Ilha Solteira, 2008

Normas de segurança e recomendações que deverão ser observadas no laboratório de aulas práticas de Microbiologia

Os laboratórios de microbiologia são locais utilizados para proceder isolamentos e manipulações de microrganismos patogênicos ou não aos homens, animais ou plantas, dependendo da área de atuação do microbiologista. Esse tipo de laboratório exige a doação de procedimentos especiais com a finalidade de prevenir tanto a introdução de microrganismos contaminantes às amostras, ou a culturas que estão sendo manuseadas, como contaminações do local de trabalho ou do próprio microbiologista. Para tanto, faz-se necessário e importante seguir as orientações abaixo:


1. É obrigatório o uso de avental. O avental deve ser de preferência comprido, com mangas longas e deve permanecer abotoado.

2. Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório.

3. O material pessoal (bolsas, livros, mochilas estojos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Deixar as bolsas nos armários que ficam no fundo da sala de aula.

4. Não inicie uma prática sem que tenha lido cuidadosamente as instruções e compreendido os objetivos e modo de execução das experiências. Pergunte quando não entender. A boa aula prática depende basicamente de que saiba o que está fazendo.

5. Checar sempre o nome dos reagentes químicos e culturas microbianas em uso.

6. Manter qualquer líquido inflamável longe do bico de Bunsen.

7. Em caso de acidentes (derramamento de culturas, quebra de placas, respingo de cultura, ferimentos, etc):

Comunicar imediatamente o pessoal técnico responsável pela aula prática.

Colocar papel toalha com álcool 70% sob o material contaminado.

8. Descarte do material:

Material contaminado (pipetas, zaragatoas, lâminas, tubos de diluição e com cultura, etc) deve ser colocado no recipiente próprio para descarte de cada um dos materiais.

Material para incubação, previamente identificado por grupo, serão colocados em recipientes próprios.

Vidros quebrados devem ser descontaminados separadamente dos demais.

Fósforo riscado, algodão e papel utilizado, colocar nas caixas de lixo.

9. A bancada deve ser desinfetada com álcool 70% antes e após o experimento.

10. Lavar bem as mãos antes e após a realização do trabalho em bancada.

11. A alça de platina deverá ser flambada antes e depois de ser utilizada, para isso, aquecer até o rubro e deixar resfriar mantendo próxima à chama.

12. Quando estiver trabalhando com culturas de microrganismos, efetue as operações próximas ao bico de Bunsen.

13. Não inalar qualquer substância diretamente.

14. Aprenda a manter os dedos, papéis, lápis, etc... longe da boca, dos olhos e narinas.

15. Culturas, lâminas, reagentes e outros materiais não devem ser removidos do laboratório sem a autorização do responsável.

16. O microscópio é um instrumento valioso e deve ser manipulado e usado cuidadosamente. Qualquer dano ou defeito deve ser comunicado ao professor. No fim de cada aula, limpar a lente ocular e as objetivas com papel macio e guardá-los nos armários.

17. Identificar todo o material com o número do grupo e data e anotar cuidadosamente os resultados de ser trabalho. Essas anotações servem de base para o aprendizado.

18. Ao terminar o período de aula, arrume corretamente o material, lavando o que deve ser lavado, apagar as luzes, verificar o bico de gás, ou chama forma desligados e não esquecer suas anotações.

PRÁTICA 1 - CULTIVO DE MICRORGANISMOS

I. Introdução

Para que os microrganismos consigam crescer e multiplicar, eles precisam retirar do ambiente em que vive todas as substâncias necessárias para a síntese de seu material celular e para a produção de energia. Essas substâncias recebem o nome de nutrientes. Em condições de laboratório, o meio de cultura é um ambiente artificial e balanceado, contendo os nutrientes necessários para suportar o crescimento de uma ou mais populações microbianas, além de permitir as correções necessárias de pH, pressão osmótica, teor de oxigênio, entre outras. Nessas condições, também é possível ter um ótimo controle ambiental sobre outras exigências, como temperatura e luminosidade. Através do cultivo de microbiano conseguimos isolar diferentes tipos de microrganismos e muitas vezes necessitamos fazer a quantificação do número de células ou esporos existentes em amostras desconhecida ou altamente concentradas. Para tanto emprega-se técnicas de diluição ou contagem de células a fresco, pelo utilização de câmaras de Newbauer.


I.1. Meios de cultura

Todos os microrganismos necessitam de uma fonte de carbono, nitrogênio, fósforo, potássio, magnésio, enxofre, sódio e traços de elementos como: Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Ca entre outros. Esses nutrientes devem estar na forma solúvel em água, para a pronta assimilação pelos microrganismos. Os meios de cultura, dependendo da finalidade de cultivo, podem ser preparados no estado líquido, sólido ou semi-sólido. A concentração de ágar nesses, deve preencher as necessidades do cultivo.

Cultura é a denominação dada ao crescimento microbiano sobre o meio de cultura. A cultura pura representa o crescimento de uma única colônia isolada no meio de cultivo. Transcorreram-se muitos anos até que as técnicas de cultura pura chegassem a forma atual. A prática de meio de cultura solidificado vem desde 1872 quando Schroeter obteve colônias isoladas de bactérias, que diferiam umas das outras, crescendo sobre um substrato composto de batata, pasta de milho e albumina de ovo. Posteriormente, Koch desenvolveu um substrato claro e transparente, usando uma gelatina translúcida que solidificava o meio, e permitia que as bactérias ficassem bem nítidas e nutricionalmente satisfeitas.

Os principais substratos atualmente empregados em meios de cultura são:

- Gelatina que é uma proteína composta de 15 aminoácidos, obtida pelo tratamento de ossos com ácido clorídrico. Ela é facilmente hidrolisada, tanto em condições ácidas como básicas, o que exige a correção do pH do meio para a neutralidade. Apresenta ainda, a desvantagem de ter o ponto de liquefação acima de 28ºC e de ser uma proteína sujeita a degradação microbiana (hidrólise enzimática).

- Ágar é um açúcar obtido de algas marinhas do gênero Gelidium, que veio substituir a gelatina. Apresenta uma série de vantagens em relação a gelatina, as quais incluem-se: (i) na hidrólise o ágar é convertido em D-galactose e pequenas quantidades de L-galactose e ácido sulfúrico; (ii) suportam autoclvagem até 120ºC, salvo em pH maior de 9,0 e menor que 4,0; (iii) os géis contendo entre 15 a 30% de ágar liquefazem somente a 95ºC e permanecem líquidos até 45ºC; (iv) sua solidificação ocorre com a formação de uma rede de moléculas abertas o suficiente para permitir a difusão de nutrientes para as células microbianas, porém suficientemente pequenas para não permitir a passagem de células microbianas para a matriz do gel; (v) serve como nutriente para um grupo muito restrito de bactérias.

- Sílica gel é um gel proveniente da acidificação de uma solução de silicato de sódio, pelo ácido clorídrico, em temperatura ambiente. A seguir os sais de sódio são eliminados por lavagem em água corrente por 24 horas. O gel resultante deve então ser esterilizado na chama ou sob irradiação UV. A adição de nutrientes é feita na forma de soluções concentradas que impregnam o gel. Por ser isento de nutrientes, a sílica-gel tem sido utilizada em estudos de organismos autotróficos.
I.1.1. Tipos de meios de cultura

Os meios de cultura podem variar em seu estado físico sendo líquido, semi-sólido ou sólido, ou quanto a sua composição. Assim, podem ser grosseiramente divididos em dois grupos: meio sintético ou meio complexo, os quais são definidos abaixo.

O meio sintético é composto de nutrientes com fórmula química definida. O meio complexo apresenta nutrientes cuja composição química não é totalmente definida. Entre tais componentes têm-se os extratos celulares de plantas, animais e microrganismos (extrato de carne, extrato de levedura, etc...).

Dentro dessas duas categorias e de acordo com sua afinidade, os meios de cultura podem ser:

-Meio simples: são meios utilizados para cultivo de microrganismos em geral;

-Meio enriquecido: alguns microrganismos não crescem facilmente em meio simples, por serem nutricionalmente exigentes, assim o meio simples deve ser suplementado com substâncias específicas, denominadas de fatores de enriquecimento. Esses fatores também podem ser usados para proporcionar um aumento de crescimento de um organismo específico em detrimento dos demais. Tais fatores podem ser proteínas, carboidratos, aminoácidos, sais biliares, vitaminas, etc...

-Meio seletivo: a incorporação de certas substâncias aos meios de cultura pode prevenir o crescimento de um determinado grupo de microrganismos, sem agir sobre outros. É o caso de antibióticos, os quais inibem o crescimento de bactérias sem afetar o de fungos. Outro exemplo é o cristal violeta, o qual impede o crescimento de bactérias Gram positivas sem afetar o crescimento das Gram negativas. De modo geral, as fontes de carbono ou de energia podem selecionar os microrganismos capazes de crescer em determinados meios.

-Meio diferencial: são meios que, pela incorporação de certos reagentes ou substâncias químicas específicas, permitem distinguir um determinado microrganismo dentro de muitas colônias. Essa diferenciação pode ser visualizada pela ocorrência de uma reação específica, atravé dos halos formados ou alterações de cores ao redor da colônia. Muito usado para seleção de microrganismos produtores de enzimas específicas como amilases, celulases, pectinases, etc...


I.1.2. Preparo de um meio de cultura

Ao formular um meio visando o cultivo de um determinado microrganismo, a meta principal de um microbiologista é chegar a uma mistura balanceada dos nutrientes exigidos para aquele microrganismos ou grupo, em concentrações tais que permitam seu crescimento.

O ponto de partida racional para o prepara de um meio deve ser a composição de uma base mineral que proporcione todos os nutrientes que possam ser supridos na forma inorgânica. Esta base, de acordo com as exigências do microrganismo em questão, poderá ou não ser suplementada com uma fonte de carbono, ou fonte de energia, ou fonte de nitrogênio, ou um fator qualquer de crescimento, ou uma mistura desses. Além disso, dependendo da finalidade a qual este meio será destinado, ele deverá ou não receber a adição de ágar na sua composição.

Um meio de cultura depois de pronto deve ser acondicionado em frascos de vidros e ser esterilizado por autoclavagem. Dependendo da composição do meio, se seus componentes forem termo-lábeis, deverão ser esterilizados por tindalização, filtração ou irradiação, e depois acrescentados ao meio após a autoclavagem.

No preparo do meio de cultura, cada um dos ingredientes da fórmula dos meios de cultura deve se calculado para a quantidade de meio que se deseja faze. Em seguida, pesar os ingredientes, usando papel impermeável, e colocá-los em frasco apropriado, ajustando-se o volume de água desejado. O frasco deve ser fechado com um tampão de algodão, protegido com papel alumínio ou jornal. Após ser autoclavado por 20 minutos a 1 atm, o meio deve ser resfriado para o inoculo dos microrganismos ou para acondicionamento em geladeira. No caso do preparo de meios sólidos em placas, após autoclavagem o meio deve ser resfriado a uma temperatura aproximada de 45ºC e em seguida distribuído nas placas de Petri estéreis, de forma asséptica. As placas poderão ser inoculadas após solidificação do meio ou serem mantidas em geladeira. Na tabela 1 apresenta-se alguns exemplos de meios de cultura.


Tabela 1 - Exemplos de meios de cultura


Ágar-nutriente


Meio Mineral

Meio de Martin

Extrato de carne 3,0 g

KH2PO4 3,0g

KH2PO4 1,0g

Peptona 5,0g

MgSO4.7H2O 2,0g

MgSO4.7H2O 0,5g

Agar 15,0g

Na2HPO4 6,0g

Dextrose 10,0g

Água destilada 1.000mL

NaCl 5,0g

Peptona 5,0g

pH 6,5

NH4Cl 2,0g

Ágar 15,0g




Glicose 8,0g

Água destilada 1.000mL




Agar 15,0g

pH 5,8




Água destilada 1.000mL







pH 5,8





I.2. Técnicas em microbiologia

I.2.1. Diluição decimal ou diluição em série

Em microbiologia, muitas vezes necessitamos fazer isolamentos ou quantificações de número de células ou esporos existentes em amostras desconhecida ou altamente concentradas. Partindo do pressuposto que cada célula viva pode dar origem a uma colônia, a contagem do número total de colônias nos fornece um número aproximado de unidades formadoras de colônias (ufc) daquela amostra.

Quando não sabemos a concentração de células ou esporos de um material, faz-se necessário diluir o material, ou seja, reduzir o número de unidades formadoras de colônias por mL de suspensão. Dessa forma viabilizamos a contagem por placa a qual deve ficar entre 3 e 300 colônias. A técnica utilizada para diluir o material é chamada de diluição decimal ou diluição em série. Na qual, parte-se de uma amostra em solução na dilução 1:10: 1g para 9g de solo ou 1mL para 9mL de água ou 10g de solo para 90mL de água. Em seguida agita-se bem essa solução para que haja uma perfeita homogeneização, dependendo do material o ideal é deixar as amostras sob agitação mecânica por 30 minutos. Depois de homogeneizado, com outra pipeta estéril, transferir 1 mL deste tubo para um segundo tubo contendo 9 mL de diluente (diluição 10-2) proceder assim até completar as diluições necessárias para a análise da amostra, como ilustrado na figura abaixo:

As concentração das diluições serão:


1:10

1:100

1:1.000

1:10.000

1:100.000

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5


I.2.2. Técnica de plaqueamento

Depois de diluídas, as amostras devem ser plaqueadas, isto é, transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura apropriado para crescimento dos microrganismos desejados. O plaqueamento pode ser feito de duas maneiras em profundidade ou em superfície.

O plaqueamento em profundidade consiste em alíquotar 0,1mL de cada diluição que se deseja plaquear no centro de uma placa de Petri. Em seguida, verter o meio de cultura esterilizado na temperatura de 45ºC, sobre o inoculo. A placa deve ser suavemente agitada para homogeneizar o inoculo com movimentos circulares, descrevendo um 8 sobre a bancada. Após solidificação total, virar a placa, mantendo a tampa para baixo e incubador na temperatura e tempo desejados. Após crescimento contar o número de colônias para cada diluição realizada.

O plaqueamento em superfície ou espalhamento em placa consiste em alíquotar 0,1mL de cada diluição que se deseja plaquear no centro de uma placa de Petri contendo o meio de cultura esterilizado e solidificado. Para impedir que os microrganismos cresçam amotoados, dificultando a contagem ou o isolamento, as amostras devem ser espalhadas de forma homogênea por toda a superfície do meio, com o auxílio de uma alça de Drigalski. A alça de Drigalski deve ser previamente esterilizada em forno, por 2 horas a 180°C, ou em autoclave, a 121°C por 20 minutos ou ainda pode-se fazer uma esterilização imediata mergulhando a alça em álcool absoluto e em seguida passando na chama (3 vezes consecutivas). No caso de se usar esse último procedimento, não esquecer de flambar a alça entre as diferentes diluições e ou amostras. Virar as placas para baixo e levá-las a incubadoras na temperatura e tempos desejados e contar o número de colônias por placa, após crescimento.


II. Objetivos

Tendo em vista a importância do apresentado acima, essa prática tem como objetivos:

- permitir um contato inicial, com os tipos de meio de cultura líquido e sólido;

- observar os efeitos da ação de antibióticos e fungicidas sobre microrganismos;

- colocar os alunos em contato com algumas técnicas de rotina em microbiologia.
III. Materiais

-1 garrafa de diluição com tampa, contendo 90ml de água estéril por grupo;

-4 tubos de ensaio com rosca, contendo 9mL de água estéril por grupo;

-1 frasco Erlenmeyr de 125mL contendo 40mL de meio agar nutriente sólido estéril para cada 2 grupos;

-1 placa de Petri estéreis por grupo;

-3 placas de Petri contendo meio agar nutriente, sendo 1 placa acrescida com estreptomicina, e 2 placas sem adição de antibiótico ou fungicida.

-2 frascos Erlenmeyer de 125mL contendo 20mL de meio agar nutriente líquido;

-pipetas de 1mL para transferência de amostras nas diluições e plaqueamento;

-suporte para tubos de ensaio;

- alça de Drigalski;

-1 bequer contendo álcool 70% para flambagem da alça de Drigalski por bancada;

-outros: álcool 70%, pano ou papel higiênico p/ limpeza da bancada; canetas de retroprogetor para identificação do material, lamparinas.


IV. Procedimento prático

IV.1. Diluição decimal

- preparo de uma amostra de solo, na diluição de 10 vezes (1:10)

-coletar amostra de solo e pesar 10g;

-transferir para garrafa de diluição, contendo 90mL de água estéril;

- agitar a suspensão por vários minutos;

- descansar rapidamente para permitir a precipitação do material mais grosseiro;

- transferir 1mL da suspensão para um tubo contendo 9mL de água (1:10 ou 1:100 em relação ao material original) e assim sucessivamente;

- a quantificação do número de células ou conídios para cada diluição pode ser feita por contagem direta (em microscópio ótico), ou por plaqueamento em meio de cultura (pela contagem do numero de colônias formadas);


IV.2. Plaqueamento

IV.2.1. Plaqueamento em profundidade

-fundir o meio BDA dos frascos Erlenmeyrs;

-desembrulhar as placas próximo à chama;

-colocar no centro de uma placa de Petri vazia 0,1mL da diluição que se deseja analisar;

-derramar cerca de 20mL do meio fundido, o meio não pode estar muito quente, por volta de 45ºC;

-fazer movimentos leves, em forma de 8 sobre a bancada, até a solidificação do meio;

-identificar a placa com o nome do aluno/grupo, a diluição e o método usado;

-virar a placa e manter a tampa voltada para baixo;

-incubar a temperatura de 30ºC a 35ºC e fazer a leitura em 48 horas.

IV.2.2. Plaqueamento em superfície

-verter o restante do meio presente no frasco Erlenmeyr na outra placa e esperar a solidificação do mesmo;

-pipetar 0,1mL da diluição que se deseja analisar e colocar no centro da placa de Petri com o meio BDA;

- esterilizar a alça de Drigalski no álcool e na chama, como descrito acima;

-espalhar a amostra com o auxílio da alça de Drigalki;

-identificar a placa com o nome do aluno/grupo, a diluição e o método usado;

-virar a placa e manter a tampa voltada para baixo;

-incubar a temperatura de 30ºC a 35ºC e fazer a leitura em 48 horas.


Cálculo para contagem das colônias:

Se na diluição 1:10.000 (10-4), conta-se 78 colônias/g, então no material original têm-se



7,8.10-5 ufc/g de solo.
VI. Meios, reagentes e soluções

VI.1. Meios
Meio Batata, dextrose, ágar (BDA)

200g de batatas

20g de dextrose

20g de ágar

1.000mL de água destilada

Inicialmente se prepara um caldo de batatas onde 200g de batatas descascadas e picadas são levadas a cozimento com 1.000mL de água por aproximadamente 20 a 30 minutos. Separar as batatas da água, reservar somente a água do cozimento. Verificar o volume de água do cozimento reservada. Pesar 20g de dextrose e 20 g de agar em um becker. Diluí-los utilizando a água do cozimento da batata, ajustar o volume para 1.000mL em uma proveta. Aquecer até a solubilização do agar. Distribuir mais ou menos 60mL de meio BDA em Erlenmeyers de 125mL, fechar os Erlenmeyrs com tampão de algodão, corretamente e autoclavar. A quantidade de meio deve ser necessária para o preparo de três placas de Petri.


TÉCNICAS EMPREGADAS EM MICROBIOLOGIA

I.Introdução

I.1. método de estrias

O método de estrias é empregado quando se tem uma suspensão concentrada de microrganismos e o se tem o objetivo de obter colônias isoladas e não quantificá-las. As placas de Petri contendo meio solidificado, deverão ser abertas próximas ao bico de Bunsen para evitar contaminação com microrganismos do ar. Com uma alça de platina, retirar alíquotas de uma suspensão concentrada de células ou conídios e, com muita leveza, estriar o meio sem ferir sua superfície, como demonstrado na figura 1. Na porção inicial das estrias a concentração do inoculo será maior, porém, na medida em que as estrias vão sendo traçadas, o inoculo irá sendo diluído até que, na porção final as células isoladas viáveis darão origem às colônias isoladas. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.






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