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Centro Universitário da Grande Dourados – UNIGRAN
Disciplina de Microbiologia
Roteiro de aula prática
Prof.(a) Adriana M. Mestriner Felipe de Melo mestriner@unigran.br



REGRAS DE BIOSSEGURANÇA PARA AULAS DE LABORATÓRIO EM MICROBIOLOGIA


a) É indispensável o uso de jaleco (mangas longas) no laboratório.

b) É proibido comer, beber, fumar, manusear lentes de contato e aplicar cosméticos nas áreas de trabalho.

c) O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das bancadas de trabalho. Deve ser mantido na bancada somente o material necessário para a realização do trabalho prático (roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações, luvas, máscara, gorro).

d) Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, aspiração de culturas) comunicar imediatamente ao responsável pela aula prática e/ou laboratório.

e) Não aquecer os tubos de ensaio com a boca virada para você.

f) Descarte de material:

  • Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias;

  • Placas de Petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada;

  • Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas;

Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes.

g) Prestar atenção nas atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes.

h) Terminados os trabalhos práticos:

  • Esterilizar alças e agulha de platina;

  • Realizar a desinfecção das bancadas e organizar os materiais utilizados;

  • Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas;

  • Desligar as lâmpadas e microscópios;

  • Limpar microscópios e cobri-los com a capa;

  • Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico.

  • Tirar o avental e guardar em bolsa adequada;



i) Noções básicas de anti-sepsia, desinfecção e esterilização:


Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.

  • Flambagem da alça ou fio de platina: tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.

  • Quando realizar uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Flambar a alça após o uso.

  • As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas e oferecidas embrulhadas em papel. Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evita que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante.

  • As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.

  • É proibida a pipetagem com a boca. Devem-se utilizar dispositivos mecânicos.

  • As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas com desinfetantes que sejam eficazes contra os agentes manipulados, ao final do trabalho ou no final do dia e após qualquer vazamento ou borrifada de material viável.

  • Todas as culturas, colônias e outros resíduos deverão ser descontaminados antes de serem descartados através de um método de descontaminação aprovado como, por exemplo, esterilização por calor úmido (autoclave).

  • Deve-se usar proteção para o rosto (máscaras de proteção, protetor facial, óculos de proteção ou outra proteção para respingos) para prevenir respingos ou sprays proveniente de materiais infecciosos ou de outros materiais perigosos.

  • No interior do laboratório, os freqüentadores deverão utilizar roupas apropriadas como jalecos, gorros ou uniformes de proteção. Antes de sair do laboratório para as áreas externas (cantina, biblioteca, escritório administrativo), a roupa protetora dever ser retirada. Deverão ser levados para casa e acondicionados em sacos plásticos, lavados e passados separadamente das outras roupas.
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PRÁTICA 1: CULTURA DE MICRO-ORGANISMOS DAS MÃOS


Objetivos:

  • Demonstrar a importância da lavagem das mãos;

  • Identificar o crescimento microbiano;

  • Praticar as técnicas de lavagens das mãos;


Procedimento:


  1. Um grupo deverá realizar cultura da mão em todas as etapas recomendadas;

  2. Outro grupo deverá aplicar o fermento biológico e passar consecutivamente ao colega seguinte e cultivar em placas todas as etapas;

  3. Identificar as placas

  4. Deixar a placa invertida em estufa bacteriológica durante 24 horas;

  5. Avaliar os resultados e descrevê-los a toda turma.
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PRÁTICA 2: CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS DO CORPO HUMANO E DO AMBIENTE

Objetivo da aula prática

  • Pesquisar micro-organismos que são habitantes normais e habituais do corpo humano, bem como do ambiente que nos cerca;

Procedimento:
1. Cada grupo deverá escolher um local do ambiente e outro local do corpo humano para executar a prática
1. Origem do material úmido

a) Introduzir a espátula ou swab no local e friccionar para retirada do material;

b) Semear na placa de petri contendo nutriente esfregando o swab fazendo movimentos de zig zag.

c) Anotar o local e o nome do grupo na placa (de preferência na parte maior da placa).


2. Origem do material seco:

a) Molhar o swab na solução fisiológica e proceder com a coleta na região escolhida.

b) Proceder como nos itens b c anteriores.

3. Cultivar o micro-organismo a 37 ºC durante pelo menos 48 horas.

4. Cada grupo enquanto espera o crescimento da cultura deverá realizar uma pesquisa sobre os seguintes pontos:




  1. Explicar o que é flora normal;

  2. Pesquisar quais são os habitantes usuais do local do corpo humano escolhido;

  3. Explicar por que a flora normal pode ser um problema na sua profissão;

  4. Citar artifícios que possam reduzir a transmissão dos micro-organismos do local escolhido pelo grupo;

5. No dia em que o grupo for observar o crescimento microbiano anotar e registrar se as colônias tinham aspecto cremoso ou filamentoso
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PRÁTICA 3: CONFECÇÃO DE LÂMINAS PARA OBSERVAÇÃO DA ESTRUTURA MICROBIANA (bactérias e fungos)
Objetivos da aula prática

  • Confeccionar um esfregaço;

  • Realizar coloração de Gram;

  • Identificar microscopicamente o resultado e classificação das estruturas quanto à coloração, morfologia e arranjo;


1ª etapa: Confecção do esfregaço para colônias cremosas

1) Pingar uma gota de água na lâmina previamente limpa e seca;

2) Flambar a alça corretamente;

2) Esfriá-la;

3) Introduzi-la nos meios de cultura;

4) Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca;

5) Espalhar o material sobre a lâmina realizando movimentos circulares;

6) Secar a temperatura ambiente;

7) Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vezes pela chama;

2ª etapa: Confecção do esfregaço para colônias filamentosas

1) Pingar uma gota de lugol ou lactofenol azul de algodão na lâmina previamente limpa e seca;

2) Flambar a alça corretamente;

2) Esfriá-la;

3) Introduzi-la nos meios de cultura;

4) Colocar o material coletado sobre o líquido;

5) Adicionar uma lamínula em cima a partir de um ângulo de 45º para evitar a formação de bolhas.

6) observar ao microscópio óptico

Realização da coloração de Gram nos esfregaços

3ª etapa: Técnica de Coloração (tradicional) para as lâminas das colônias cremosas
1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!

2) Lavar rapidamente em água corrente;

3) Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto;

4) Lavar rapidamente em água corrente;

5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool-cetona;

6) Lavar rapidamente em água corrente;

7) Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica ou safranina por 30 segundos;

8) Lavar novamente em água corrente;

9) Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço;

10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.


 

Técnica da coloração de Gram modificada (indicada pelo Ministério da Saúde)



  1. cubra o esfregaço com violeta-de metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;

  2. adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta de-metila e deixe agir por mais 45 segundos;

  3. escorra o corante e lave em um filete de água corrente. Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;

  4. escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;

  5. adicione álcool etílico (99,5°GL) sabre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante;

  6. lave em um filete de água corrente;

  7. cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;

  8. lave em um filete de água corrente;

  9. deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;

  10. coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; e

  11. leia em objetiva de imersão (100 X).

 3ª etapa: Observação microscópica





Colônia filamentosa Colônia cremosa
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PRÁTICA 4: MICROSCOPIA ÓPTICA: COMPONENTES E MANIPULAÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
O microscópio é um aparelho destinado a ampliar a imagem das microestruturas observadas, utilizando para isso, a luz.

Objetivos da aula prática

  • Conhecer o microscópio;

  • Manipulá-lo corretamente;

  • Realizar a focalização de uma estrutura microbiana;



Como utilizar o microscópio

  1. Afastar as objetivas da mesa de platina;

  2. Colocar a lâmina na platina e prender com as presilhas;

  3. Assegurar que a objetiva de 4x é a primeira a ser observada;

  4. Levantar totalmente a mesa de platina.

  5. Agora, observando pela ocular movimente o botão macrométrio de forma a abaixar a mesa até que uma imagem nítida seja observada;

  6. Regular a intensidade luminosa e focar usando o diafragma e o condensador;

  7. Mudar para a objetiva de 10x e a partir de agora regular o foco com o micrométrio; Caso a imagem seja perdida, retornar novamente ao primeiro procedimento;

  8. Centrar no campo visual o microorganismo a observar;

  9. Caso a imagem nítida foi obtida, mudar para a objetiva de 40x e ajustar o foco com o botão do micrométrio;

  10. Após obter a imagem nítida na objetiva de 40x, antes de proceder ao passo seguinte acrescer óleo de imersão na lâmina e então posicionar a objetiva de imersão ajustando o foco fino com o micrométrio.

  11. Após observação remover a lâmina, limpar a platina e a lente, as oculares, diminuir a intensidade luminosa e desligar.

  12. Realizar a anotação das estruturas observadas.





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PRÁTICA 5: CONTROLE QUÍMICO DO CRESCIMENTO MICROBIANO



Objetivos da aula prática

  • Demonstrar métodos químicos de controle de crescimento microbiano;

  • Conhecer métodos e meios para minimizar a contaminação dos ambientes;

  • Descrever agentes químicos usuais na prática da sua profissão


Procedimento:
1- Aplicar uma cepa microbiana em uma placa com auxílio de um Swab;

2- Cada grupo deverá escolher pelo menos um agente químicos para ser testado;

3- Aplicar os discos de papéis e em seguida aplicar em cada disco o produto a ser testado;

4- Deixar a placa invertida em estufa bacteriológica;

5- Realizar leitura do crescimento diferenciando uma cultura de fungo e de bactéria;

6- Descrever meios físicos e químicos de controle de microorganismos.



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PRÁTICA 6: MÉTODOS FÍSICOS DE CONTROLE MICROBIANO


Objetivos da aula prática:

  • Demonstrar métodos físicos de controle de crescimento microbiano;

  • Conhecer métodos e meios para minimizar a contaminação dos instrumentais;

  • Descrever principais formas físicas e\ou físico químicas para o controle de micro-organismos


Procedimento:
1- Cada grupo deve receber tubos com caldo de cultura contaminado;

2- Após escolher o método físico de controle de microorganismos, aplicar o tubo de ensaio no método escolhido;

3- Semear o Swab do caldo contaminado após a ação do agente esterilizante ou desinfetante em placas contendo meio de cultura;

4- Deixar a placa invertida em estufa bacteriológica;

5- Realizar leitura do crescimento;

6- Discutir qual foi o método mais adequado de esterilização.



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PRÁTICA 7: ISOLAMENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERESSE



Objetivos da aula prática

  • Semear diversos tipos de materiais clínicos;

  • Instruir os estudantes na técnica de transferência de cultura de maneira asséptica para subcultivo.

  • Obter cultura pura;



Técnicas de Semeadura/ Subcultivo


a) Esgotamento simples: líquido

b) Esgotamento Quaternário (sólido)

c) Espalhamento sobre a superfície: alça

d) Pour-plate:

e) Tubo com meio sólido em pé:

f) Tubo com Agar inclinado: técnica de "zig-zag" na superfície;

g)Tubo com meio líquido: homogeneização com alça de platina

Procedimento:


  1. Fazer limpeza da bancada e anti-sepsia das mãos;

  2. Marcar o tubo/placa que serão utilizados;

  3. Flambar a alça;

  4. Remover o tampão de algodão;

  5. Introduzir a alça na cultura de bactéria;

  6. Com a alça, delicadamente, semear na placa de Petri;

  7. Flambar novamente a alça; A partir de um ponto já semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no restante da placa.




  1. Repassar a amostra do tubo para a placa com a alça de platina;

  2. Flambar a boca do tubo antes e depois de usá-lo;

  3. Inocular na placa com meio de cultura seguindo a indicação para isolamento de cultura pura (esgotamento simples e o quaternário);

  4. Incubar a 37ºC



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PRÁTICA 8: REALIZAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DE ANTIBIOGRAMA



Objetivos da aula prática:

  • Realizar testes que possam predizer a sensibilidade do microorganismo de interesse in vitro para aplicação terapêutica racional.

  • Adicionalmente demonstrar a ação de antibióticos naturais, como aqueles presentes nos alimentos (alho)

As espécies microbianas freqüentemente inibem o crescimento umas das outras tanto pela excreção de produtos resultantes do seu metabolismo que alteram as condições ambientais, como pela produção de algumas substâncias químicas específicas: os antibióticos. Os antibióticos podem inibir o crescimento ou eliminar microrganismos e, para poderem ser utilizados clinicamente, não deverão afetar significativamente os organismos eucarióticos nas doses terapêuticas.



Procedimento


  • Com auxílio de swab estéril, introduzir no caldo BHI, após retirar o excesso de material, por compressão na parede do tubo, e espalhar a cultura pura por toda a placa de Petri com meio de Müeller-Hinton.

  • Deixar a placa secando durante 5 minutos.

  • Com o auxílio de uma pinça levemente flambada, retirar os discos de antibióticos e colocá-los sobre a superfície da placa de petri, fazendo leve compressão.

  • Distribuir os discos mantendo uma distância de 2 cm da borda da placa e 3 cm entre eles. Colocar discos em círculo e no centro.

  • Incubar a placa a 37oC, por 24 horas.



Placas preparadas no dia anterior
 

Leitura das placas através da medida, em mm, do halo de inibição do crescimento bacteriano em torno do disco do antimicrobiano.



Análise dos resultados, de acordo com a tabela padrão de Kirby-Bauer.


Procedimento alternativo


Ao invés de aplicar discos de antibióticos aplicar fatias de alho para verificar o potencial antimicrobiano desse alimento.



VALORES PARA KIRBY BAUER

LIMITES PARA INTERPRETAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA (Tabela padrão)

Antibiótico

Símbolo

Concentração

Sensível

Intermediário

Resistente




























































































Resultados do seu grupo


Antibiótico

Símbolo

Concentração

Valor

Resultado

Observações




























































































Atividade extra-classe: interpretar o resultado de um antibiograma
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PRÁTICA 9: ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA

Objetivos da aula prática:

Determinar se a água está potável ou não para consumo humano;



6.1. Determinação do NMP / coliformes totais e fecais

Materiais:


Caldo lauril sulfato

9,9 mL

9,0 mL


5 mL (2x concentrado);

Estufa bacteriológica

Caldo verde brilhante bile

Pipetas esterilizadas de 10 mL, 2mL e 5mL;

Caldo E.C.

Banho Maria a 44,5ºC;

Tiosulfato de sódio 2%

Alça de platina

Tubos de Duhram


Procedimento

a) Coleta da amostra:

1) Utilizar frasco estéril de +- 250 mL (água tratada tem que ter acréscimo de 100 mg de tiosulfato de sódio);

2) Coletar assepticamente;

3) Transportar a amostra refrigerada e se possível semeá-la na primeira hora;



b) Análise Presuntiva

    1. Inverter 20 vezes a amostra para homogeneização completa;

    2. Semear 5 mL da amostra em tubo de ensaio contendo 5 mL de caldo lauril sulfato de sódio com concentração dupla, com tubo de Duhram;

    3. Semear 1mL da amostra em tubo de ensaio contendo 9 mL de caldo lauril sulfato com concentração simples, com tubo de Duhram (1:10)

    4. Semear 0,1 mL da amostra em tubo de ensaio contendo 9,9 mL de caldo lauril sulfato com concentração simples, com tubo de Duhram;

    5. Realizar todas as diluições em triplicata;

    6. Incubar em estufa a 37ºC por 24 horas;

    7. Verificar crescimento nos tubos. Presença de turvação no meio e gás nos tubos de Duhram indicam presença de coliformes.

    8. Anotar em quantos tubos houve crescimento, anotando especificamente as diluições.


c) Determinação do NMP de coliformes totais

  1. Inocular as amostras em que houve crescimento bacteriano (uma amostra de cada diluição)

  2. Realizar a semeadura em triplicata de cada tubo;

  3. Incubar em estufa a 37ºC por 24 horas;

  4. Realizar leitura do crescimento, anotando quantos tubos apresentaram crescimento, em cada diluição.

  5. Determinar o NP utilizando a tabela própria;


d) Determinação do NMP de coliformes fecais

  1. Inocular as amostras em que houve crescimento bacteriano (uma amostra de cada diluição), utilizando alça de platina, em caldo E.C.

  2. Realizar a semeadura em caldo EC

  3. Incubar em B.M> a 44,5 ºC por 24 horas;

  4. Realizar leitura do crescimento, anotando quantos tubos apresentaram crescimento, em cada diluição;

  5. Determinar o NMP utilizando tabela própria (anexo)


Resultados:

Quantificar o NMP de coliformes totais e fecais da amostra

Apresentar conclusão quanto à utilização desta amostra;

Apresentar sugestões.


Questões para atividades extracurriculares:

1) Existem outros métodos de se testar a qualidade microbiológica da água? Cite-os.

2) Qual a importância deste teste? Quem deve fazê-lo periodicamente?

Material de apoio: tabela de NMP de coliformes utilizando 3 tubos de diluição com inoculação de 10ml, 1 ml e 0,1 ml de amostra


Tubos positivos

10,0 mL


Tubos positivos

1,0 mL


Tubos positivos

0,1 mL


Resultado

0

0

0

<3

0

0

1

3

0

1

0

3

0

2

0

6

1

0

0

4

1

0

1

7

1

1

0

7

1

1

1

11

1

2

0

11

2

0

0

9

2

0

1

14

2

1

0

15

2

1

1

20

2

2

0

21

2

2

1

28

2

3

2

30

3

0

0

23

3

0

1

39

3

0

2

64

3

2

0

43

3

1

1

75

3

1

2

120

3

2

0

93

3

2

1

150

3

2

2

210

3

3

0

240

3

3

1

460

3

3

2

1100

3

3

3

2400

Água potável: ausência de coliformes fecais
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PRÁTICA 10: DETECÇÃO DE FUNGOS EM ALIMENTOS
Finalidade: avaliar a carga fúngica presente nos diferentes tipos de alimentos.
Alimentos avaliados: granola, paçoca, farinha de milho, farinha de mandioca e leite
Procedimento:
- pesar 10 gramas do alimento (leite= pipetar volume de 10 mL) e colocar em frasco contendo 90 mL de solução salina estéril (diluição 1:10 – 10-1). A partir da diluição 1:10, coletar, com auxílio de pipeta sorológica estéril, um volume de 1,0 mL e transferir para tubo de ensaio contendo 9,0 mL de solução salina estéril (diluição 1:100 – 10-2). A partir da diluição 1:100, coletar um volume de 1,0 mL e transferir para outro tubo contendo 9,0 mL de solução salina estéril (diluição 1:1000 – 10-3).
- Homogeneizar bem em cada diluição e desprezar os 1,0 mL restantes, conforme esquema ilustrado a seguir:
Transferir 1,0 mL de cada diluição e cultivar “pour-plate” com agar Sabouraud, Mycosel® e DRBC fundidos. Para a amostra de leite utilizar também o meio CHROMagar Candida. Homogeneizar bem, esperar solidificar, identificar as placas e incubar a 25ºC. Observar o comportamento do crescimento fúngico nos diferentes meios de cultura.
A interpretação dos resultados será realizada na próxima aula prática.



Interpretação dos resultados
Proceder a contagem das colônias de fungos e anote nos quadros abaixo. Fazer a estimativa do número de UFC (Unidades Formadoras de Colônias) por grama e/ou mL de alimento.
Descrição produto\meio
1:10
1:100
1:1000
BIBLIOGRAFIA

MADIGAN, M. T. Microbiologia de Brock. 10 ed. São Paulo: Printice Hall, 2004.

MIMS, C.; PHAYFAIR, J.; ROITT, I.; WALKELIN, D.; WILLIAMS, R. Microbiologia Médica. São Paulo, Manole, 1999.

PELCZAR, M. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2. ed. V. 1 e 2. São Paulo: Pearson Education do Brasil, 1997.

PORTO C.S.; MARTINS E., E.E.C. Micologia Médica: Fungos, Actinomicetos e algas de interesse médico. Sarvier: São Paulo, 1991.

SIDRIM, J.J.C.; MOREIRA, J.L.B. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais de Micologia Médica. Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, 1999.

STROHL, W. A.; ROUSE, H.; FISHER, B. D. Microbiologia Ilustrada. Porto Alegre: Artmed, 2004.



C
ENTRO UNIVERSITÁRIO DA GRANDE DOURADOS

 CURSO DE NUTRIÇAO

   

 


 

ROTEIRO PRÁTICO DE MICROBIOLOGIA BÁSICA

 

 


 

Disciplina: Microbiologia Básica e dos alimentos


Prof. Adriana M. M. Felipe de Melo

Aluno (a): ____________________

RGM: ________________________

 

Dourados - MS



2014



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