Universidade Federal de Minas Gerais Elisa Rennó Donnard Moreira Triagem Líquida para o Sistema de Duplo-Híbrido em Leveduras Belo Horizonte



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Universidade Federal de Minas Gerais

Elisa Rennó Donnard Moreira

Triagem Líquida para o Sistema de Duplo-Híbrido em Leveduras


Belo Horizonte

2008

Elisa Rennó Donnard Moreira

Triagem Líquida para o Sistema de Duplo-Híbrido em Leveduras

Monografia apresentada ao Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Dr. J. Miguel Ortega

Co-Orientador: Dr. R. Daniel Gietz
Belo Horizonte

2008

Agradecimentos
Agradeço meu orientador Miguel, por todas as oportunidades e por estar sempre presente. A todos os amigos do Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento, Flávia e Viviane pela ajuda nos experimentos e por tornarem o trabalho muito mais agradável. à minha família e amigos pelo apoio. Às meninas do EMAC, pois o simples fato do grupo existir já é divertido. Aos amigos canadenses, Dan Gietz e Cheryl St. Laurent, por tornarem este trabalho possível.

SUMário
Resumo........................................................................................................ I

ABSTRACT.................................................................................................... II

LISTA DE ABREVIAÇões............................................................................... III

1-Introdução............................................................................................. 8

2-Justificativa.......................................................................................... 15

3-Objetivos................................................................................................ 16

3.1-objetivos específicos......................................................................... 16

4-material e métodos.............................................................................. 17

4.1-Leveduras.................................................................................................. 17

4.2-Bactérias................................................................................................... 19

4.3-Plasmídios................................................................................................. 20

4.4-Bibliotecas................................................................................................ 21

4.5-Protocolos................................................................................................. 22



5-RESULTADOS.............................................................................................. 29

5.1-Triagem com Rtel1 e biblioteca de cDNA de testículo de camundongo.................. 29

5.1.1-Transformação com KGY37 e Rtel1............................................................. 29

5.1.2-Transformação sequencial com biblioteca de cDNA........................................ 29

5.1.3-Triagem Liquída...................................................................................... 30

5.1.3-Triagem em placas de meio sólido............................................................... 31

5.1.4-Ensaio de LacZ........................................................................................ 34

5.1.6- Triagem com a porção C-terminal de Rtel1.................................................. 35

5.2-Triagem com Trim2 e Biblioteca de cDNA de cérebro de camundongo.................. 35

5.2.1-Transformação com KGY37: Trim2 + Biblioteca............................................ 35

5.2.2-Triagem Líquida...................................................................................... 35

5.2.3-Ensaio de LacZ........................................................................................ 37



5.2.4-Validação dos clones positivos................................................................... 37

5.3-Triagem com isca TRIM32 e biblioteca de músculo esquelético humano................ 38

5.3.1-Transformação com KGY37: TRIM32 + Biblioteca......................................... 38

5.3.2-Triagem Líquida...................................................................................... 38

5.3.3-Ensaio de LacZ........................................................................................ 41

5.3.4-Validação dos clones................................................................................ 41

5.4-Triagem com Trim2 e biblioteca de cérebro de camundongo em Y190................... 42

5.4.1-Transformação com Y190: Trim2 + Biblioteca............................................... 42

5.4.2-Triagem Líquida...................................................................................... 42

5.4.3-Ensaio de LacZ........................................................................................ 42

5.4.4-Validação dos clones positivos................................................................... 43

6-Discussão................................................................................................ 44

7-Conclusões....................................................................................... 48

8-Referências...................................................................................... 49

RESUMO
O sistema de duplo-híbrido consiste em um método genético que seleciona produtos de cDNA presa que interagem com uma proteína isca de interesse. Aqui reportamos dois protocolos de triagem líquida que melhoram este método valioso e eliminam o a trabalhosa triagem clássica em placas de meio sólido. Para avaliar a eficácia da triagem líquida, usamos a linhagem de S. cerevisiae KGY37, três iscas diferentes: h-TRIM32, m-Rtel1 ou m-Trim2 e as respectivas bibliotecas de cDNA: músculo esquelético humano, testículo de camundongo e cérebro de camundongo. A linhagem de levedura Y190 também foi utilizada para uma triagem com a isca Trim2. Estas combinações tinham sido previamente triadas com o método clássico, permitindo uma comparação direta com método novo. Cada triagem consistiu em 120 receitas de transformação (LiAc/PEG/ssDNA) resultando em 40 milhões de transformantes (ensaio com TRIM32) e duas abordagens foram utilizadas: (i) na primeira, 60 transformações foram divididas em 10 frascos de cultura com meio SD-W-L-H +Amp +3AT (0,5 mM para KGY37 e 2,5 mM para Y190); (ii) na segunda abordagem, 60 transformações foram divididas em quatro placas 96-deepwell. As culturas foram incubadas a 30ºC e diluídas de acordo com testes anteriores, resultando em crescimento das culturas na presença de interação entre as proteínas. Em todas as triagens as culturas crescidas foram plaqueadas e estes positivos iniciais foram analisados para confirmar as interações. Verificamos a ativação do gene repórter LacZ, a maioria dos clones eram positivos e foram depois validados e seqüenciados. Concluímos que a quantidade de interações obtidas na triagem líquida é comparável ao método clássico e o meio líquido é uma alternativa mais fácil, econômica e eficiente para ensaios de duplo-híbrido.
ABSTRACT

Yeast two-hybrid method consists of a genetic trap that selects for prey cDNA products within a library that interact with a bait protein of interest. Here we report two protocols of liquid screening that further improve this valuable method and eliminate the laborious classic screening in solid medium. To evaluate the accuracy of the liquid screening, we used the yeast strain KGY37, three different baits: h-TRIM32, m-Rtel1 or m-Trim2 and the respective cDNA libraries: human skeletal muscle, mouse testis and mouse brain. The yeast strain Y190 was also used in a screen with Trim2. These combinations had been previously screened with the classic method allowing for a direct comparison to the novel method. Each screening consisted of 120 regular LiAc/PEG/ssDNA transformation recipes (trafos) comprising 40 million transformants (TRIM32 assay) and two different approaches were used: (i) in the first approach 60 trafos were divided into 10 culture flasks with SD-W-L-H +Amp +3AT (0,5mM for KGY37 and 2,5mM for Y190) medium; (ii) in the second approach 60 trafos were divided into four 96-deepwell plates. The cultures were incubated at 30˚C and diluted according to previous tests, resulting in grown cultures upon two-hybrid interaction. In all screens, grown cultures were plated and these initial positives were further analyzed. To confirm the interaction status, we verified the activation of the other reporter gene, LacZ. Most grown cultures were positive for LacZ activation and these positives were then validated and sequenced. In conclusion, the amount of interactions obtained in the screens is comparable to the classic method and the liquid media is a faster, more economic and more efficient method for two-hybrid screens.




LISTA DE ABREVIAções
µg- micrograma (10-6 g)

µL- microlitro (10-6 L)

ng- nanograma (10-9 g)

3AT- 3-Aminotriazol

Amp- Ampicilina

cDNA- DNA complementar ao mRNA

ºC- graus Celsius

DNA- Ácido Desoxirribonucléico

g- gramas

His- Histidina

HIS3- Gene de uma enzima da síntese de histidina

KCl- Cloreto de potássio



LacZ- gene da b-galactosidase

LB- Meio Luria Bertani

Leu- Leucina

M- Molar


mg- miligrama (10-3 g)

MgCl2- Cloreto de magnésio

MgSO4- Sulfato de magnésio

mM- milimolar (10-3 M)

min- minuto

mL- mililitro (10-3 L)

mRNA- RNA mensageiro

NaCl- Cloreto de sódio

pMol- picomol (10-12 M)

RNA- Ácido ribonucléico

rpm- rotações por minuto

Tris- Tris-hidroximetil-aminometano

Trp- Triptofano

V-Volts


X-Gal- 5-bromo-4-cloro-3-indolil--d-galactopiranosídio
1- INTRODUÇão
A análise de genes por comparação de seqüências e identificação de motivos comuns indica possíveis funções exercidas pelas proteínas. Estes dados, entretanto, não são suficientes para determinar a função exata dessas proteínas, tornando necessário o uso de técnicas de genômica funcional como nocaute, análise proteômica ou perfil metabólico. Nem sempre os dados gerados por estes métodos são suficientes e muitas vezes eles dependem de trabalho excessivo e alto investimento 1. A importância dos estudos de interações físicas entre proteínas cresce à medida em que mais informações são obtidas de pesquisas genômicas.
A determinação funcional das proteínas é de fundamental importância para o avanço na compreensão de processos biológicos 2. Processos metabólicos como síntese de DNA, ativação transcricional, tradução protéica, localização de proteínas e transdução de sinal são dependentes de complexos protéicos. Na última década, uma grande variedade de métodos foram desenvolvidos para detectar, analisar e quantificar interações proteína-proteína, incluindo espectroscopia de ressonância, NMR, ensaios de duplo-híbrido, tagging de peptídeos combinado com espectrometria de massa e tecnologias baseadas em fluorescência 3.
O sistema de duplo-híbrido, inicialmente desenvolvido por Fields e Song 4 é um ensaio genético molecular que detecta interações proteína-proteína e tornou-se um procedimento padrão para a biologia molecular. O método é conduzido na levedura Saccharomyces cerevisiae. Embora existam adaptações a outros organismos, S. cerevisiae é um modelo melhor para o desenvolvimento do sistema pela rapidez do crescimento, simplicidade de transformação e por ser uma célula eucariota, proporcionando ambiente apropriado para o estudo de proteínas desse clado in vivo 5. O sistema é baseado no produto do gene GAL4 de leveduras, uma proteína com dois domínios funcionais que é responsável pela ativação de genes envolvidos no metabolismo da galactose. O domínio de ligação ao DNA (GAL4DL) interage com a seqüência UAS do promotor de GAL1 e o domínio de ativação (GAL4DA) estimula a transcrição. O método de duplo-híbrido (Figura 1A) consiste na separação das seqüências codificadoras para esses domínios (GAL4DL e GAL4DA) e na inclusão destas em plasmídios diferentes, de modo a ficarem fusionadas a seqüências de DNA codificando proteínas cuja interação deseja-se verificar (GAL4DLproteínaA e GAL4DAproteínaB). Os plasmídios devem ser introduzidos numa linhagem de levedura contendo genes repórteres. Um exemplo é o gene LacZ de E. coli fusionado ao promotor de GAL1. A interação das proteínas A e B será responsável pela ativação da transcrição do gene repórter LacZ. A atividade de -galactosidase pode ser detectada por um ensaio com o substrato cromogênico X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--d-galactopiranosídio), identificando as leveduras que contém a interação pela cor azul resultante da metabolização do X-Gal.

O desenvolvimento do sistema permitiu a utilização de uma proteína de interesse (isca) para encontrar proteínas desconhecidas (presas) que interajam com ela 6. Esta versão do método utiliza outro gene repórter GAL1-HIS3 (Figura 1B). A região codificadora da proteína de interesse é fusionada ao domínio de ligação (GAL4DL), num plasmídio contendo o gene TRP1 e uma biblioteca de cDNA é construída em um vetor GAL4DA contendo o gene LEU2. Leveduras deficientes para os genes TRP1, LEU2 e HIS3 (com uma cópia de HIS3 controlada pelo promotor GAL1) são transformadas com os dois plasmídios, e então submetidas a uma seleção em meio SD sem os aminoácidos Trp, Leu e His. A presença de uma interação entre a proteína isca e um produto da biblioteca de cDNA permitirá o crescimento da levedura. Como a maioria das leveduras utilizadas para este fim apresentam transcrição basal do gene repórter, é comum a adição de um inibidor competitivo da enzima produto de HIS3 denominado 3-aminotriazol.


A)

B)



Esquema 1: Representação Sistema de Duplo-híbrido em Leveduras. Detalhes no texto.
O sistema de duplo híbrido consiste numa melhor abordagem para o estudo de interações proteína-proteína em relação aos estudos in vitro devido à comum necessidade de algumas proteínas do ambiente celular para que ocorram as corretas modificações pós-traducionais, mesmo que muitas vezes o núcleo das leveduras não seja semelhante à situação real. Outra vantagem do sistema é a possibilidade de detectar mesmo interações fracas, embora isto se torne uma desvantagem pelo número elevado de falso-positivos 7.O ensaio também é considerado adequado para os estudos de interações protéicas por ser simples, barato e não depender de conhecimento prévio sobre as interações para se realizar uma triagem, além de poder ser automatizado 8.
O sistema também apresenta suas limitações. Uma grande desvantagem é a seleção de muitos falso-positivos, como já mencionado anteriormente, o que exige do pesquisador um esforço em vão, para analisar clones que inicialmente parecem interações relevantes e análises posteriores revelam ser espúrias. Esta seleção de falso-positivos mostra-se ainda mais elevada nos ensaios de triagem de bibliotecas 6. Embora a repetição dos ensaios possa distinguir corretamente as interações verdadeiras das falsas, fica clara a necessidade de análises laboriosas para avaliar a veracidade dos clones recuperados 9.
Algumas proteínas podem tornar difícil a triagem pelo sistema por sua expressão ser tóxica para as leveduras tornando difícil ou até inviável o crescimento das leveduras 7. Fragmentos menores da proteína podem ser usados com o objetivo de eliminar a toxicidade2. Não há relatos de monitoramento paralelo do crescimento das leveduras sob efeito da isca, o que é normalmente feito nesses casos é esperar indefinidamente pelo crescimento das colônias nas placas.
A triagem de uma biblioteca é, além de tudo, muito trabalhosa, por ser realizada em um número elevado de placas de diâmetro grande. Uma mistura de transformação deve ser dividida em 100 placas de 15 cm de diâmetro (300 µL por placa) para uma triagem mais eficiente, reduzindo parcialmente o aparecimento de falso-positivos 2.
Tradicionalmente, a seleção de leveduras contendo ativação do gene HIS3 no sistema de duplo-hibrido é feita em placas de meio SD -Trp -Leu -His suplementado com 3-Aminotriazol, um inibidor do produto de HIS3, como mencionado, que torna o crescimento possível somente para leveduras contendo uma ativação considerável do gene HIS3. Trabalhos reportando o uso de meio líquido foram descritos anteriormente como uma alternativa para a seleção de ativadores do gene HIS3 10, relatando maior eficiência quando comparado ao ensaio de LacZ. A possibilidade de automação deste ensaio foi relatado como também um grande atrativo (desenvolvimento em placas 96-deepwell). Para o sistema de tri-híbrido 11 também foi descrita uma abordagem em meio líquido que mostrou-se capaz de distinguir interações verdadeiras de falsos positivos pela análise do crescimento da levedura no meio durante um intervalo fixo de 24hs de crescimento 12.
Em nosso laboratório, Queiróz e colaboradores realizaram testes iniciais com as leveduras Y190 e HF7C para o desenvolvimento de uma metodologia de triagem em meio líquido. O objetivo da adaptação seria melhorar a seleção de interações de duplo-híbrido, diminuindo a incidência de falso-positivos. No trabalho, foi utilizada como modelo de interação forte: a proteína p53 e o antígeno Large T 13, enquanto as interações fracas foram representadas por um mutante conhecido de p53 (54.2) e o antígeno Large T. Os testes mostraram que a levedura Y190 em meio líquido era capaz de distinguir a interação forte (Gal4DL-p53 + Gal4DA-LargeT) e o controle negativo (Gal4DL-p53 + Gal4DA) em meio SDs -W-L-H líquido suplementado com 3-aminotriazol (3AT) após 24 horas de crescimento e após diluições. Concentrações de 3AT 2,5 mM foram suficientes para minimizar o crescimento devido a transcrição basal de HIS3 na levedura Y190 em procedimentos de 24 horas de cultivo e de diluições, não sendo necessárias concentrações da droga tão elevadas (35 mM) como em meio SDs sólido.

Os ensaios foram conduzidos por co-transformação de leveduras S. cerevisiae HF7c e Y190 com 1 g de pISCA (expressão de Gal4DL-p53), 1 g de pSEMPRESA (expressão de Gal4DA) e 0; 0,1; 1; 10 ou 100ng de pPRESA (expressão de Gal4DA-largeT). Simulando assim a triagem de clones positivos em concentrações crescentes em meio a clones de controle negativo. Os protocolos (Figura 2) consistiram em diluições (1:10 e 1:100) de culturas de leveduras co-transformadas, durante o intervalo de 120 horas, finalizando-se pela análise de ativação de gene repórter HIS3 por medida de densidade do meio SDs líquido em espectrofotômetro. A diferença principal entre os protocolos consiste na amplitude (1:10 ou 1:100) e momento (após 24, 48 ou 72 horas de cultivo) da primeira diluição. Os resultados mostraram o protocolo F (Figura 2F) como sendo mais eficiente na recuperação dos clones positivos. A primeira diluição deste protocolo é de 1:10 após 72 horas de crescimento pós-transformação, seguida por uma diluição 1:100 24 horas depois da primeira. Enquanto em leveduras S. cerevisiae HF7c este protocolo apresentou sensibilidade semelhante à observada na seleção convencional em placas, em leveduras S. cerevisiae Y190 a sensibilidade foi um pouco melhor.




Figura 2: Protocolos testados no trabalho de Queiroz e colaboradores.

A seleção em meio líquido também foi testada de forma robotizável, distribuindo a mistura de transformação em placas 96-deepwell. Um cálculo da correspondência colônia-poço permitiu a comparação da seleção robotizável com a triagem em placas convencional mostrando uma equivalência dos métodos na recuperação de clones. O número de poços de uma placa deepwell para cada transformação deve ser maior se a incidência de clones é mais freqüente, enquanto que em triagens nas quais poucos clones são obtidos é possível diminuir o número de poços utilizados.


Outra metodologia testada foi a de crescimento em cultura única, com o intuito de selecionar clones com interações mais fortes através de uma competição. Esta metodologia só foi possível com a levedura Y190, pois testes iniciais mostraram que a linhagem HF7C não era capaz de distinguir interações fortes e fracas. Os testes de competição mostraram que a cultura contendo leveduras portando a interação forte, independentemente da presença de leveduras com interação fraca ou controle negativo, apresentou crescimento e as leveduras resultantes foram positivas no teste LacZ. Criando uma nova perspectiva para a triagem de interações de duplo-híbrido, de maneira mais eficiente e prática. Todavia, as simulações que desenvolveram o sistema precisavam ser testadas em um ambiente de seleção real e, se possível, desenvolvidas também com a colaboração de outros grupos experientes no sistema. Neste trabalho, buscamos o preenchimento destas perspectivas.

2- JUSTIFICATIVA

A seleção de clones positivos no sistema de duplo-híbrido pela ativação do gene repórter HIS3 tem sido desenvolvida convencionalmente em placas com meio sólido, demandando um número elevado de placas e tornando o método muito trabalhoso. A observação da alta incidência de falso-positivos também é responsável por diminuir o interesse no método.


Com o trabalho de Queiróz e colaboradores, duas novas metodologias (robotizável e em cultura única) foram testadas e mostraram grande potencial para a recuperação de clones positivos com menor interferência de falsos ativadores.
Por essa razão, este trabalho procurou validar os protocolos inicialmente desenvolvidos em nosso laboratório para a aplicação da triagem em meio líquido nos ensaios com bibliotecas complexas, proporcionando uma triagem mais rápida e fácil para o método de duplo-híbrido.
Dada a necessidade de alta eficiência de transformação nas triagens com bibliotecas complexas, uma nova cepa de leveduras, KGY37, desenvolvida para o sistema de duplo-híbrido 14 foi submetida a testes de validação com os protocolos de triagem líquida.



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