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Universidade Federal de Minas Gerais


Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Bioquímica e Imunologia

Métodos e Técnicas em Bioquímica e Imunologia
Prof: Salas


Ana carolina Campi

Bernardo

Daniel Moreira

Fernando Tunes

Jorge Freitas

Simone fonseca

Belo Horizonte, 11 de Setembro de 2000


I- Introdução:
Uma grande parte das investigações bioquímicas envolve a purificação de materiais, como proteínas, antes de serem feitas algumas considerações porque estas moléculas devem estar relativamente livres de contaminantes para serem propriamente caracterizadas.

Em 1903, foi descrito por um botânico, Mikhail Tswett, o processo de cromatografia que foi inicialmente a separação de pigmentos de plantas em solução através do uso de um adsorvente líquido.

Métodos bem mais modernos de purificação por procedimento cromatográfico foram desenvolvidos, entre eles a Fine Particule Liquid cromatography (FPLC).

Em todos os métodos, uma mistura de substâncias para serem fracionadas estão dissolvidas em uma fase líquida ou gasosa, conhecida como fase móvel. Esta solução resultantepercorre uma coluna que consiste de uma matris sólida porosa denominada fase estacionária.

As interações dos solutos com a fase estacionária atuam retardando o progresso do soluto através da matris, de modo que este retardamento varie com propriedades de cada soluto.


  • FPLC:

A FPLC é uma cromatografia de altíssima resolução para peptídeos em relação aos outros tipos de processos cromatográficos já que o poro da coluna é cerca de 500 A, apropriado para a separação desta classe de moléculas. Outras razões como alta recuperação da amostra com manutenção da integridade estrutural e atividade biológica e também a alta velocidade da corrida tornam este método o melhor pra purificação de proteínas.

As separações obtidaspor FPLC são determinadas em características das cargas de diferntes moléculas da amostra aplicada.

Basicamente, existem 3 tipos de Sistemas utilizados na FPLC:


  1. Sistema Mono Q: os grupos ligados à coluna são aminas terciárias ou quartenárias (NR3/NR2), conferindo carga positiva ao sistema. Interage com moléculascarregadas negativamente (troca aniônica), as quais são eluídas por solução com sal.

  2. Sistema Mono S: neste sistema, grupo sulforado (SO3-) está ligado à coluna conferindocarga negativa ao sistema. Da mesma forma que no Sistema Mono Q, as moléculas carregadas, no caso, positivamente são eluídas por meio de solução contendo sal.

  3. Sistema Monp P ou cromatofocalização:ocorre uma especial troca aniônica para separação das moléculas de acordo com o ponto isoelétrico delas. A coluna é semelhante à da Mono Q, a diferença consiste na solução que é utilizada para a eluição protéica, que é o Poly Buffer. Este tampão consisteem uma mistura de soluções, que ao percorrer a coluna forma um gradiente de pH nesta. Assim, as proteínas são desligadas da coluna de acordo com o pH.



  • Eletroforese:

O processo eletroforético consiste na migração de íons em um campo elétrico e é amplamente utilizada para uma separação analítica de moléculas biológicas.

O uso da eletroforese movem em razões diferentes como resultado de cargas diversas presentes nestas proteínas.

Existem vários processo de eletroforese, desde a eletroforese em papel, em gel, SDS-PAGE, por capilaridade e a separação bidimensional (focalização isoelétrica).

Na SDS-PAGE, assim como toda separação, tem uma fase estacionária que é o gel e a móvel, o tampão. As proteínas atravessam o ge, por corrente elétrica. O gel de poliacrilamida é o meio de sustentação escolhido porque são quimicamente inertes, sendo formado pela polimerização da acrilamida. Concentrações variáveis de acrilamida e de metileno-bisacrilamida (reagente que promove interligações) no momento da polimerização determinam o tamanho dos poros.

As proteínas podem ser bem separadas em função da massa em condições desnaturantes. Para induzir o estado desnaturante, a solução protéica primeiro tem que ser dissolvida em uma solução contendo SDS (Dodecil Sulfato de Sódio). Este é um detergente que mantém a proteína totalmente carregada negativamente. O -mercaptoetanol também é adicionado afim de reduzir as pontes de sulfeto, que poderiam impedir a ação do SDS.

Após a corrida, as proteínas podem ser visualizadas no gel, corando-as com prata ou com azul de Croomassie.


II-Objetivos:





  • Separar uma uma amostra de proteínas no sistema FPLC através de uma coluna de troca catiônica (MONO –S Sepharose). Para isso será utilizado um sistema binário de eluição composto de dois solventes, A e B.




  • Análise e quantificação da amostra de proteína purificada por Atividade Amidásica, pelo Método de Bradford, por SDS-PAGE e por Western Blot



III-Materiais e Métodos:


  • SOLUÇÕES UTILIZADAS NA CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA:


TAMPÃO A (500 ml) – 0.5 mM de NaCl, 0,025 mM de tetraborato de sódio, 5mM de EDTA pH 9,2.
TAMPÃO B (250 ml) – 200 mM de NCl, 0,025 mM de tetraborato de sódio, 5mM de EDTA pH 9,2.
As soluções foram preparadas com água MQ, filtradas e estocadas a 4 oC, e, imediatamente antes de usá-las, deaeradas.
A AMOSTRA: Solução de proteínas provenientes do látex de uma espécie de mamão. O látex foi retirado, filtrado e passado em uma coluna de gel filtração (Sephadex G-10) e em seguida em uma coluna de troca catiônica (CM-Sephadex C-50). Após cada etapa cromatográfica foi feito o ensaio enzimático e dosagem de proteína pelo método de Bradford a fim de determinar sua concentração protéica. A amostra aplicada possuía uma concentração de 4 mg/ml e o volume aplicado foi de 100 µl.


  • PROCEDIMENTO (FPLC):

Após a lavar as bombas com os tampões lavou-se a coluna com o Tampão A. Após a aplicação da amostra (100 µl) aumentou-se gradativamente a concentração do Tampão B no sistema até coletar o pico de interesse. Ao término da corrida a coluna deve ser lavada com o Tampão A estando pronta para uma nova corrida.




  • ATIVIDADE AMIDÁSICA:

Em uma alíquota de 1000l da fração obtida após o processo cromatográfico, acrescentou-se 0.6 volumes de acetato de sódio 1M (600l) e 0.2 volumes de acetato de sódio 2.5M (200l), obtendo-se um volume final igual a 1800l. Esse procedimento foi realizado para que o pH da fração, que se encontrava em 9.3 fosse ajustado para 5.0 - pH ideal para a dosagem a ser realizada.

A atividade amidásica é associada com a atividade proteolítica de uma enzima. O procedimento mede a hidrólise enzimática do substrato BAPNA após incubação a 37 oC.

Solução final de 753l: tampão fosfato 50 mM pH 8.0, EDTA 0.2 mM, cisteína 5mM, substrato BAPNA e enzima a ser dosada.


  • 188.25l de fosfato de sódio 200mM

  • 60.25l de cisteína 200mM

  • 7.5l de EDTA 500mM

  • 3l de BAPNA 200mM

  • 494l da fração obtida após ajuste do pH.

Controle negativo:

  • em substituição à fração testada, utilizou-se 494l do tampão de eluição B.

Controle positivo:

- utilizou-se 5l de protease e 489l de tampão fosfato 200mM.

Após a incubação da enzima com o tampão e o substrato por um tempo variado a reação foi paralisada com 60 µl de ácido acético 60%.

A atividade específica é determinada como o número de unidades por mg de proteína. (1 unidade (u) = quantidade de enzima que hidrolisa 1 nmol de BAPNA por segundo).

A solução foi incubada a 37°C,overnight. Após esse período a reação foi interrompida com 60 l de ácido acético 60% e a leitura realizada no espectrofotômetro UV-Vis a 405nm.



  • DOSAGEM DE PROTEÍNA:

A dosagem de proteína da amostra coletada foi feita pelo método de microensaio de Bradford:


-Reagente de Bradford:

  • 10 mg Coomassie Brilliant Ble G-250

  • 5,0 ml etanol 95%

  • 10 ml ácido fosfórico 85%

  • q.s.p. 100 ml de H2O bidestilada.

  • Filtrar em filtro comum, ler a 595nm.

0,5 – 1,5ug proteína / 20 ul (placa de Elisa de 94 poços – 180 ul do reagente), para o cálculo da concentração: [ ] = Fc  Abs  Cv  C


Fc: fator de calibração = média dos valores de ug / Abs (média) do padrão.

Cv: correlação do volume para 1.000 ug.

Cd: correlação da diluição.

Abs: absorbância média das duplicatas.




  • SDS-PAGE:


SOLUÇÃO DE PRATA:

50ml de solução de prata (15,14ml de NaOH 0,36%, 1ml de NH4OH e 2,86ml de AgNO3 10%).

Para obtermos uma solução de AgNO3 10% foram adicionados 0.5g de AgNO3 a 5ml de água destilada.

Como a solução estoque de NaOH era 12%, foram adicionados 0.45ml dessa solução à 1ml de NH4OH, 2.86ml de AgNO3 10% e 45.69ml de água destilada para obtermos 50ml de solução de prata.



SOLUÇÃO REVELADORA:

50 ml de solução reveladora (12.5 l de ácido cítrico 2.3M, 50µl de formaldeído, 50 ml de água destilada aquecida).


SOLUÇÃO STOP:

50 ml de solução stop (5% de ácido acético).



GEL DE POLIACRILAMIDA 12%:

O gel de poliacrilamida é um gel bifásico, que apresenta uma fase de concentração/empilhamento (para que todas as proteínas comecem do mesmo ponto no gel) e uma fase de separação (que separará as proteínas por seu peso molecular).

O gel pode ser feito de diversos tamanhos, mas o mais utilizado é o minigel. Depois de montadas as placas deve-se primeiro preparar o gel de separação.

Para preparar 5 ml do gel de separação:

-2 ml de solução estoque de acrilamida 30% 29:1 (acrilamida : bisacrilamida)

-1,25 ml de Tris 1M pH 8.8

-1,646 ml de água

-50 l de solução SDS 10%.

Após homogeneizar bem adicionar 4 l de TEMED (catalisador da reação) e 50 l de APS (radicalizador) e aplicar no gel, deixando aproximadamente 1cm para posterior aplicação do gel de concentração. Como a acrilamida polimeriza irregularmente em contato com o ar, deve-se acrescentar uma camada de água, esperar aproximadamente 30 min para o gel polimerizar.

Para preparar 2,5 ml gel de concentração:

-0,417 ml de solução estoque de acrilamida 30% 29:1

-0,625 ml de Tris 0,5M pH 6.8

-1,4 ml de água

-25 l de solução SDS 10%.

Após homogeneizar bem adicionar 2 l de TEMED e 25 l de APS, aplicar e colocar o pente (que vai fazer as canaletas para a aplicação das amostras).

O gel pode ser utilizado após 30 minutos ou mais. Ele deve ser corrido em tampão glicina a 100V até o corante sair (aproximadamente 1h). As amostras devem ser ressuspendidas em tampão LB proteína 2x antes de serem aplicadas.

O gel foi lavado duas vezes com água destilada por 10 min e então fixado em solução de metanol 50% por 1h. Após esse período o gel foi lavado com água destilada por 1 min e deixado agitando por 25 min em 50ml de solução de prata (15,14ml de NaOH 0,36%, 1ml de NH4OH e 2,86ml de AgNO3 10%) para corá-lo.

O gel foi lavado duas 2 vezes com água destilada por 5min antes de ser colocado em uma solução reveladora (12.5 µl de ácido cítrico 2.3M, 50µl de formaldeído, 50 ml de água destilada aquecida).

Após o aparecimento das bandas, o gel foi passado para a solução Stop (5% de ácido acético) e fotografado.



  • WESTERN BLOT:

As proteínas resolvidas eletroforeticamente no gel de acrilamida 12% foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose pela utilização de um campo elétrico.

Esta membrana foi submetida a anticorpos específicos para a proteína em questão (anti-simonase). Os anticorpos não ligados foram eliminados através da lavagem do filtro e os complexos antígeno-anticorpo formados, foram identificados através da enzima fosfatase alcalina associada a um anticorpo secundário anti-IgG, que reconhece o anticorpo proteína-específico usado inicialmente.

Um substrato cromogênico foi, então, usado para visualizar a atividade dessa enzima.



IV-Resultados:


  • Cromatografia:

A proteína de interesse fosse eluída quando a porcentagem do tampão B chegou em 90%. A simetria do pico indica quanto à pureza da enzima.




  • Atividade Amidásica:

Dosagem da atividade amidásica em espectrofotômetro a 405nm.

  • Amostra purificada: 0,422

  • Contole negativo: 0,096

  • Controle positivo: 1,738



  • Método de Bradford:

Curva padrão (figura 1):







  • SDS-PAGE:

Visualização das bandas no gel:

Figura 1 - Resolução eletroforética em gel SDS-PAGE 12%. Na canaleta ? foi aplicado o extrato bruto, na canaleta ? foi aplicado lisozima, na canaleta ?????? foram aplicadas diferentes quantidades da amostra purificada.



  • Western Blot:

Observou-se somente uma banda na amostra purificada que foi reconhecida pelo anticorpo9figura 2):



V-Discussão dos Resultados:
A proteinase foi purificada, sendo uma proteína monomérica de acordo com o resultado dos perfil cromatográfico e os resultados obtidos na eletroforese SDS-PAGE.

A proteína que foi purificada pela FPLC é realmente a proteína sperada por Ter sido reconhecida por anticorpos anti-simonasesespecíficos para tal de acordo com o resultado obtido no Western Blot.



A cncentração da proteína na amostra foi determinada a partir da curva padrão e o fator de purificação, assim como o rendimento das etapas de purificaçãoforam determinados por meio da atividade amidásica.

VI-Bibliografia:
OAKLEY, B. R., Kirsch, D. R. & Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteíns in poliacrilamide gels. Anal. Biochem. 105: 361-363, 1980.
STRYER, L. Bioquímica. 4a edição, editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995.
WATSON, J. D. et. al.. O DNA Recombinante. 2ª Edição - Editora UFOP. Ouro Preto/MG. 1997.

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