Universidade Federal de Santa Catarina Aula Prática 4 Centro de Ciências Biológicas



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Universidade Federal de Santa Catarina Aula Prática 4

Centro de Ciências Biológicas Semestre: 2011/1

Departamento de Bioquímica
Disciplina: BQA 7208 - Bioquímica Básica

Roteiro para aula prática: Avaliação da atividade da amilase salivar.


INTRODUÇÃO:
A atividade enzimática pode ser avaliada medindo-se a velocidade de consumo do substrato ou a velocidade de aparecimento do produto. Esta atividade depende de vários fatores, tais como o tempo de reação, a concentração da enzima, a concentração do substrato, a temperatura, o pH do meio e a presença de cofatores e/ou inibidores. Para exemplificar estes conceitos, nesta aula prática será avaliada a atividade da amilase salivar. A -amilase é encontrada nos animais (sangue, saliva e suco pancreático), plantas, fungos e bactérias. Esta enzima é um endo-amilase e hidrolisa as ligações glicosídicas do amido, glicogênio, poli e oligossacarídeos ao acaso. Como resultado da ação não ordenada da amilase salivar, obtém-se rapidamente uma mistura complexa de produtos de hidrólise que incluem: amido solúvel, maltodextrinas, maltoses, e, eventualmente, glicose. Na boca, a amilase salivar tem participação na digestão de carboidratos. A amilase pancreática é a maior responsável pela digestão glicídica no duodeno. Esta enzima é também normalmente encontrada no soro e a elevação de sua atividade enzimática sérica pode auxiliar no diagnóstico de diversas patologias pancreáticas (obstrução, tumores, pancreatite aguda, etc).

O amido é composto pela amilose (não-ramificada) e amilopectina (ramificada). A amilose forma micelas hidratadas que adsorvem IODO, presente na solução de lugol, em suas espirais helicoidais, apresentando coloração azul-violeta.




OBJETIVOS:


  1. Avaliar a ação da amilase salivar sobre o seu substrato (amido);

  2. Verificar o efeito do pH sobre a atividade da amilase salivar.


PROCEDIMENTOS:
A. ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR
1. Preparação da solução de saliva

- Um aluno do grupo doa a sua saliva em um Becker.

- Para diluição (1:10), adicionar em um tubo:

0,5 mL de saliva

5 mL de água destilada

Reservar até o momento de uso


2. Preparação dos tubos

- Tomar 11 tubos de ensaio limpos, nomear um deles de B (Branco) e numerar os restantes de 1 a 10.

- Adicionar a todos os 11 tubos:

2 mL de água destilada

2 gotas de lugol
3. Preparação da solução de reação

- Misturar, em um béquer:

5 mL de solução de amido

2 mL de tampão fosfato (pH 6.8)

2 mL de NaCl 0,9%.

* Retirar 2 gotas e adicionar ao TUBO B (Branco)


Adicionar 0,5 mL de solução de saliva à solução de reação e IMEDIATAMENTE:

* Retirar 2 gotas e adicionar ao TUBO 1

* Após 1 minuto, retirar mais 2 gotas e adicionar ao TUBO 2

* Repetir sucessivamente, em intervalos de 1 minuto, a transferência de 2 gotas para os tubos seguintes até o tubo que não se observe mais a coloração com o iodo (ponto acromático);

* Adicionar 5 mL de água destilada a todos os tubos e agitar. Ler as absorbâncias num fotocolorímetro a 620-660 nm, zerando o aparelho com o conteúdo do TUBO B (Branco).

B. EFEITO DO pH SOBRE A ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR
1. Preparação dos tubos

- Marcar 3 tubos de ensaio correspondentes a diferentes pHs (4,0; 6,8 e 9,5) e adicionar a todos:

2 mL de água destilada

2 gotas de lugol (reagente contendo iodo).


2. Preparação dos tubos contendo tampões de pHs diferentes

- Marcar 3 tubos e adicionar a cada um:

5 mL de AMIDO

2 mL de NaCl

- Adicionar ao primeiro tubo 2 mL de tampão acetato (pH 4,0);

- Adicionar ao segundo tubo 2 mL de tampão fosfato (pH 6,8);

- Adicionar ao terceiro tubo 2 mL de tampão glicina (pH 9,5);

- Manter todos os tubos a temperatura ambiente por 5 minutos.


3. Tubos de reação.

- Adicionar 0,5 mL da enzima (solução de saliva diluída) em cada um dos tubos contendo amido e tampões com pHs diferentes e agitar;

- Após 5 minutos de reação, transferir 2 gotas para os seus respectivos tubos contendo IODO.

- Adicionar a todos os tubos contendo IODO 5 mL de água destilada.

- Compare as cores entre os diferentes tubos. Qual foi o pH ideal para atividade da amilase?
ROTEIRO PARA O RELATÓRIO:
- Introdução: Escrever uma breve introdução teórica sobre atividade enzimática e sobre a enzima amilase salivar

- Materiais e métodos: Descrever detalhadamente o que foi feito no laboratório, além do material utilizado.

- Resultados: Experimento 1: Traçar duas curvas num mesmo gráfico, colocando os tempos (minutos) na abscissa e as absorbâncias para os tubos contendo IODO na ordenada. Comparar a curva de consumo de substrato (amido) entre os diferentes grupos. Experimento 2: Comparas as cores deste experimento com as cores do primeiro experimento. Deduzir e explicar qual é o melhor pH (pH ótimo) para a enzima amilase salivar.

- Discussão: Discutir os resultados obtidos.



- Bibliografia: Descrever a bibliografia utilizada para o relatório.

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