Universidade Federal do Pará



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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : agosto /2016 a janeiro/2017

(X) PARCIAL

( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Estudo de valorização da agricultura familiar cacaueira do Estado do Pará através da obtenção de amêndoas e cacau em pó com maior teor de compostos bioativos

Nome do Orientador: Jesus Nazareno de Souza
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade : Engenharia de Alimentos
Unidade: Instituto de Tecnologia
Laboratório: CVACBA – Centro de Valorização Agroalimentar de Compostos Bioativos da Amazônia
Título do Plano de Trabalho: Avaliação da estabilidade dos compostos fenólicos, alcaloides e proteínas após as etapas de fermentação, secagem e torrefação de cacau (Theobroma cacao var. Forasteiro), em função de variáveis físico-químicas.
Nome do Bolsista: Rosiane do Socorro dos Reis de Sousa


Tipo de Bolsa :

(X) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/CNPq-AF

( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/UFPA-AF


( ) PIBIC/INTERIOR



  1. INTRODUÇÃO

O Brasil é um dos maiores produtores de cacau, destacando-se na região amazônica o estado do Pará. As sementes de cacau, de acordo com estudos clínicos, possuem alto teor de compostos fenólicos que atuam de forma benéfica a saúde principalmente devido ao efeito antioxidante destas moléculas. No Pará, a cultura cacaueira desponta com notável relevância no cenário nacional, representada por diversos municípios produtores com destaque para os de Tomé-Açú, Placas e Medicilândia, segundo levantamento realizado em 2014 pela Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC).

As sementes de cacau são submetidas aos processos de fermentação e secagem para originar amêndoas que são usadas na produção de cacau em pó e chocolate (WOLLGAST, 2004; ANDRES-LACUEVA et al., 2008). Os processos de fermentação e secagem para obtenção do cacau comercial são de grande importância para a diminuição do amargor e da adstringência das amêndoas de cacau que são atribuídos aos polifenóis, a cafeína, a teobromina e aminoácidos, entre outros componentes naturalmente presentes nessa matéria prima (LUNA et al., 2002; MISNAWI et al., 2005).

A elevada capacidade antioxidante apresentada pelas sementes, em função da presença de compostos bioativos, desperta também o interesse em diversas pesquisas, tanto no sentido de otimizar as etapas do processo produtivo afim de preservar esses compostos, sem prejuízo do sabor característico, quanto no interesse em isola-los para diversas aplicações na indústria farmacêutica e de alimentos (SHAHIDI, 1994; EFRAIM, 2004).

Muitas técnicas analíticas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de identificar e quantificar um maior grupo de biomoléculas em matrizes alimentares com maior eficácia e confiabilidade, como é caso do uso recorrente da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) na determinação de polifenóis presentes em amêndoas de cacau.

A Espectroscopia no Infravermelho Próximo (NIR) associada à quimiometria apresenta-se como uma excelente alternativa, dada a possibilidade do desenvolvimento de métodos analíticos rápidos, não destrutivos e que permitem obter e interpretar uma grande quantidade de informações sobre a amostra. Diversos exemplos de aplicações bem sucedidas são descritos na literatura para diversos analitos e matrizes, com finalidades que incluem aplicações quantitativas, detecção de adulterações e modelos de classificação de amostras de acordo com a origem geográfica ou até mesmo em função de variáveis do processo (BAETEN et al.,2015; ROGGO et al., 2007; PASQUINI, 2003).




  1. JUSTIFICATIVA

O cacau (Theobroma cacao L.) é uma planta originária do continente americano, provavelmente das bacias dos rios Amazonas e Orenoco, de onde se espalhou por toda região e onde ainda se encontram algumas espécies em estado nativo. Os principais produtos do fruto do cacaueiro são a polpa e as sementes. Sendo que as sementes são os principais atrativos econômicos, entretanto, correspondem a apenas 10% do peso do fruto. A polpa pode ser consumida in natura, enquanto que a casca, que representa cerca de 80% do peso do fruto fresco, pode ser utilizada em alimentação animal. As sementes da subespécie Forasteiro oriunda da Região Amazônica são reconhecidas por apresentar aroma e sabor mais requintado nos produtos finais a partir delas desenvolvidos. O beneficiamento das sementes de cacau origina diversos produtos semi-manufaturados, como a massa de cacau (liquor), o cacau em pó e a manteiga de cacau e produtos manufaturados, como os chocolates e achocolatados (DRUMMOND, 1998).

Esses produtos de cacau se enquadram entre os alimentos altamente energéticos e estimulantes, cujo sabor é uma característica muito importante. Além de estar intimamente relacionado à variedade e à origem, o sabor é influenciado pelo processamento, cujo desenvolvimento potencial deste depende principalmente dos processos de fermentação e torração (ZAK; KEENEY, 1976). Dentre as modificações que ocorrem durante a fermentação, pode-se ressaltar a hidrólise específica de proteínas, especialmente da fração globulina (VOIGT; BIEHL, 1993), proporcionando a formação de peptídeos e aminoácidos (MOHR; LANDSCHREIBER; SEVERIN, 1976; ROHAN; STEWART, 1967) e a hidrólise da sacarose em glicose e frutose (ROHAN, T. A.; STEWART, 1967). Os compostos formados na fermentação são os precursores do sabor de cacau desenvolvido na torração através da reação de Maillard (FORSYTH; QUESNEL, 1957; PEZOA, 1989)

Desta forma, faz-se necessário desenvolver pesquisas relacionadas aos aspectos tecnológicos do processamento do cacau em nível nacional, visto que o Brasil ainda é um dos maiores produtores mundiais de cacau e também representa um importante mercado para a indústria.




  1. OBJETIVOS

    1. Objetivo geral

Caracterizar e verificar a estabilidade dos compostos fenólicos e alcaloides, teor de lipídeos e proteínas presentes em sementes de Theobroma cacao var. Forasteiro, após as etapas de fermentação, secagem e torração, em função de variáveis físico-químicas.



    1. Objetivos específicos



  • Caracterização física das amêndoas de cacau.

  • Avaliar a qualidade proteica do nibs triturado das amêndoas de cacau, através da quantificação de aminoácidos totais após a fermentação, secagem e torrefação.

  • Correlacionar os valores quantificados de aminoácidos totais com a Espectroscopia do Infravermelho Próximo (NIR) afim de usá-la com uma ferramenta rápida e eficiente de acompanhamento das transformações bioquímicas.

  • Avaliar o perfil cromatográfico dos compostos fenólicos e alcaloides das sementes de cacau após as etapas de fermentação, secagem e torrefação, utilizando cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC).

  • Quantificação dos principais compostos fenólicos e Alcaloides utilizando HPLC.



  1. MATERIAIS E MÉTODOS

    1. Matéria Prima

A matéria prima a ser estudada neste projeto será sementes do cacau da variedade Forasteiro, fornecidas pela Cooperativa Agrícola Mista de Tomé-Açu (CAMTA), Pará. Os frutos serão colhidos maduros e quebrados no dia (sem descanso) e em 48 horas (com descanso) após a colheita, e as amêndoas serão fermentadas em cochos de fermentação durante sete dias e secas ao sol em lona.




    1. Caracterização física das amêndoas
      1. Umidade (Amêndoas e Nibs)


O teor de umidade foi determinado a partir das amêndoas e nibs triturados em estufa com circulação de ar a 105 ºC, de acordo com o método 931.04 (AOAC, 1997).
      1. Prova de Corte


A prova de corte nas amêndoas fermentadas e secas (100 unidades) de cada ensaio estudado sera realizada, através de um corte longitudinal, para avaliar a qualidade das amêndoas em função da coloração dos cotilédones – indicando o resultado em porcentagem de amêndoas marrons, violetas com partes marrons e violetas – e do grau de fermentação através da verificação de sulcos nos cotilédones, expressando o resultado em porcentagem de amêndoas bem, parcialmente e mal compartimentadas (BRASIL, 2008).
      1. Analises físicas diversas


Serão determinadas as seguintes características nas amêndoas de cacau fermentadas e secas, de acordo com Brasil (2008):

  • Massa de 100 amêndoas, selecionadas aleatoriamente;

  • Número de amêndoas em 100g;

  • Fração da composição das amêndoas: 100 amêndoas serao pesadas e descascadas manualmente, separando a testa (película que envolve a semente), o gérmen e os cotilédones (nibs). A fração dos nibs sera pesada e expressa em porcentagem.



    1. Torração das amêndoas

Aproximadamente 80g de amêndoas de cacau nas condições de fermentação e secagem descritas anteriormente, serão adicionadas em bandejas de alumínio e colocadas em estufa, Quimis, aquecida na temperatura de 123ºC e tempo de 35 minutos. Após o processo de torração, as amêndoas serão retiradas da estufa e mantidas em dessecador até atingir a temperatura ambiente, aproximadamente 25 °C.


    1. Determinação de Nitrogênio total

O mais comum dos procedimentos para a determinação das proteínas é a determinação um elemento ou de um grupo pertencente as proteínas. Os elementos analisados geralmente são carbono ou nitrogênio.

O Método Kjeldahl baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico e catalizador para a digestão até que o carbono e o hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da Proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. É adicionado NaOH concentrado e aquece-o para a liberação a amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução acida padronizada.




    1. Extração dos compostos fenólicos e alcaloides

O método de extração será baseado em (Risner, 2008) com algumas modificações: serão pesados 0,2g do nibs triturado, adicionando-se 10mL de solução extratora (85% H20 e 15% Metanol acidificado com 0,3% de ácido acético) em tubos de ensaio, ficando sob agitação por 5 minuto em vortex e em repouso por 1 minuto. Após o repouso o extrato será filtrado em filtros de papel com porosidade de 14 µm.


    1. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

Foi desenvolvido um método HPLC para quantificação dos alcaloides xantínicos (cafeína, teobromina e teofilina) e dos compostos fenólicos majoritários dos nibs de cacau ((+)-catequina, (-)-epicatequina e procianidina B2), adaptado de Gonçalves (2016). Será estabelecido um gradiente composto de fase móvel A (H2O ultrapura com 2,5% de ácido acético) e B (Acetonitrila com 2,5% de ácido acético) com um tempo total de corrida de 16 minutos. Iniciando-se com (5 – 25 %) de B no intervalo de 0 a 9 min, seguida de (25 – 95 %) de B no intervalo de 9 a 12,5 min, estabilizando a 95% de B por um minuto de 12,5 a 13,5 min e retornando as condições iniciais do gradiente de 5% da fase B de 13,5 minutos até o fim da corrida com 16 minutos.

O fluxo sera de 1 mL/min, com volume de injeção de 20 µL de amostra, coluna Kinetex 2,6 µm C18 100Å, 100x4,6 mm (Phenomenex) mantida a 30°C, em um equipamento HPLC Thermo Scientific série Ultimate 3000 (United States), equipado com bomba quartenária (LPG-3400RS), injetor automático (WPS-3000SL Analytical), auto sampler (TCC-3000RS), detector DAD (DAD-3000), software de dados (Chromeleon 7.1 SR2) e célula de fluxo (Standard Analytical). A identificação e a quantificação de dos compostos sera realizada utilizando o detector de arranjo de diodos (DAD), monitorando o comprimento de onda de 280nm. Os compostos serão identificados baseando-se nos tempos de retenção e por comparação com os espectros de absorção de padrões da empresa sigma e quantificados através de uma curva de calibração.




    1. Espectros do infravermelho próximo (NIR)

Os espectros na região do NIR serao obtidos em aparelho espectrofotômetro de espectrometria de infravermelho próximo com transformador Fourier, Marca Termo Scientific, Modelo Nicolet Antaris II AHY150075, na faixa de número de onda de 10001,03 a 3999,64 a intervalos que variam de 3,86, sendo os dados obtidos na forma do logaritmo da recíproca da reflectância (A= log 1/R).


  1. RESULTADOS PARCIAIS




    1. Caracterização física das amêndoas

Os valores de umidade das amêndoas secas devem ficar abaixo de 8,0% estabelecido pelas especificações de padronização recomendadas pelo BRASIL (2008). Para um correto armazenamento e transporte, evitando assim o desenvolvimento de fungos (OETTERER, 2006). Desse modo as amêndoas analisadas apresentaram-se dentro do padrão estabelecido (Tabela 1)


Tabela 1. Caracterização da amêndoas fermentadas e secas


Tempo da quebra pós colheita


Amostra

Umidade (%) Amêndoas

Umidade

(%) Nibs

Peso de 100 Amêndoas (g)

Nº de Amêndoas em 100g

Fração dos cotilédonis (%)

48 hrs

F.(0)

56,08 ± 3,62

34,27 ± 0,43

206,06

49,00

50,90

Dia

F.(0)

51,04 ± 1,04

33,41 ± 0,19

189,59

54,00

54,49

48 hrs

F.(2)

50,59 ± 1,24

35,51 ± 0,41

196,01

50,00

51,85

Dia

F.(2)

51,27 ± 2,53

37,03 ± 0,61

183,60

56,00

58,80

48 hrs

F.(4)

50,03 ± 1,93

40,61 ± 0,35

193,40

53,00

56,13

Dia

F.(4)

50,81 ± 5,36

40,46 ± 0,57

159,68

63,00

68,20

48 hrs

S.L.(7)1

8,71 ± 0,64

6,36 ± 0,29

90,06

111,00

75,06

48 hrs

S.L.(7)2

7,72 ± 0,12

6,68 ± 0,07

94,00

106,00

79,57

48 hrs

S.L.(7)3

8,02 ± 0,42

7,68 ± 0,32

101,46

99,00

75,26

Dia

S.L.(7)1

6,67 ± 0,44

5,68 ± 0,25

92,00

107,00

74,23

Dia

S.L.(7)2

6,41 ± 0,46

5,88 ± 0,16

85,00

115,00

81,30

Dia

S.L.(7)3

6,44 ± 0,11

6,21 ± 0,03

91,00

109,00

83,12

As umidades da parte interna das amêndoas (Nibs) se mostraram menor que as das suas respectivas amêndoas de cacau, circunstância facilmente justificada pelo fato destas segundo Lee (2003), serem envolvidas por uma polpa doce, mucilaginosa com 80% de umidade, que ficam parcialmente aderidas em sua casca durante o pré-processamento.



O número de amêndoas em 100g variou entre as amêndoas fermentadas e secas, em virtude da diferença entre a umidade. O rendimento dos nibs teve média próxima de 80%, próximo ao encontrado por Efraim (2004). A amêndoas provenientes dos frutos quebrados no dia apresentaram maior rendimento em comparação as fermentadas 48 horas depois.

Tabela 2. Teste de corte e compartimentação dos cotilédones das amêndoas fermentadas e secas.


Tempo da quebra pós colheita

amostra

Teste de corte

Compartimentação dos Cotilédones


Marron


intermediaria


Violeta

Bem fermentada


Intermediario

Mal fermentada

48 hrs

F.(0)

0

0

100

0

0

100

dia

F.(0)

0

0

100

0

0

100

48 hrs

F.(2)

1

13

86

0

27

73

dia

F.(2)

2

20

78

2

41

57

48 hrs

F.(4)

6

35

59

4

33

63

dia

F.(4)

18

43

39

9

47

44

48 hrs

S.L.(7)1

65

34

1

64

24

12

48 hrs

S.L.(7)2

50

48

2

37

46

17

48 hrs

S.L.(7)3

59

41

0

46

34

20

dia

S.L.(7)1

57

39

4

41

41

18

dia

S.L.(7)2

38

61

1

38

48

14

dia

S.L.(7)3

60

40

0

40

47

13
De acordo com a tabela 2 é possível observar a transformação gradativa da coloração violácea (cor dos nibs das sementes não fermentadas) para marrom ao longo dos dias de fermentação a ao fim da secagem.

As amêndoas fermentadas com descanso (quebra após 48 hrs) apresentaram um número maior de amêndoas bem fermentadas em comparação a sem descanso (quebra no dia) após a secagem. Entretanto verificou-se que praticamente metade das amêndoas analisadas apresentaram coloração marrom e o restante em coloração intermediaria e violácea, isto pode estar relacionado as condições climáticas com temperaturas baixas durante a secagem.



    1. Determinação dos compostos fenólicos e Alcaloides pelo metodo HPLC.

Os resultados da análise de HPLC (Tabela 2) demonstraram que não houve uma redução significativa na concentração de alcaloides após as etapas de secagem e torrefação. Alguns dos compostos tiveram aumento nas suas concentrações, Segundo Zhu (2002) esse aumento deve-se a despolimerização de compostos fenólicos de alto peso molecular. Nas concentrações de (+) epicatequina houve uma pequena redução após a etapa de torração comparando as amêndoas fermentadas sem descanso (quebra dos frutos no dia) e com descanso (quebra após 48 hrs), entretanto, para os outros compostos não provocou variações e reduções significativas. Verifica-se que a quebra dos frutos após 48 horas antes da fermentação foi a condição em que a catequina, (+) epicatequina e procianidina b2 apresentaram maior concentrações após a secagem. As transformações ocorridas durante a fermentação serão posteriormente analisadas, na qual se verificara melhor a redução ou aumento dos compostos nesta etapa.

Tabela 3. Concentração dos principais compostos bioativos das amêndoas secas e torradas.

Tempo da quebra pós colheita


Amostra

Alcaloides

Compostos fenólicos

Cafeína (µg/gNS)

Teobromina (µg/gNS)

Teofilina (µg/gNS)

(+) catequina (µg/gNS)

(+) epicatequina (µg/gNS)

procianidina b2 (µg/gNS)

48 hrs

S.L.(7)1

1794,64 ± 0,01

9625,65 ± 0,10

395,67 ± 0,00

51,54 ± 0,46

2722,35 ± 0,29

1709,57 ± 0,04

48 hrs

S.L.(7)2

1598,09 ± 0,00

8722,46 ± 0,04

356,60 ± 0,00

47,82 ± 0,46

2053,93 ± 0,04

1447,92 ± 0,00

48 hrs

S.L.(7)3

1791,45 ± 0,00

9293,43 ± 0,01

409,50 ± 0,00

64,41 ± 0,57

3039,63 ± 0,35

1903,18 ± 0,00

Dia

S.L.(7)1

1377,29 ± 0,01

8879,31 ± 0,03

329,19 ± 0,00

50,85 ± 0,18

1118,35 ± 0,01

1043,90 ± 0,01

Dia

S.L.(7)2

1395,12 ± 0,00

9799,21 ± 0,02

353,64 ± 0,00

41,98 ± 0,00

1037,88 ± 0,00

1024,81 ± 0,00

Dia

S.L.(7)3

1676,67 ± 0,00

10236,84 ± 0,01

341,22 ± 0,03

47,51 ± 0,01

1285,61 ± 0,01

1200,30 ± 0,01

48 hrs

T.(7)1

1638,55 ± 0,01

8419,19 ± 0,06

348,86 ± 0,02

212,34 ± 0,09

1380,60 ± 0,01

1198,19 ± 0,00

48 hrs

T.(7)2

1698,72 ± 0,00

9179,80 ± 0,00

385,15 ± 0,00

106,19 ± 0,67

1486,12 ± 0,00

1339,26 ± 0,01

48 hrs

T(7)3

1606,08 ± 0,00

9969,57 ± 0,05

340,92 ± 0,04

52,91 ± 0,47

816,61 ± 0,00

1016,07 ± 0,01

Dia

T.(7)1

1605,49 ± 0,01

9712,22 ± 0,03

350,56 ± 0,00

78,93 ± 0,38

831,67 ± 0,01

1045,73 ± 0,07

Dia

T.(7)2

1395,63 ± 0,00

8374,77 ± 0,00

338,11 ± 0,00

12,80 ± 0,00

874,10 ± 0,00

1022,34 ± 0,01

Dia

T.(7)3

1160,11 ± 0,00

7055,69 ± 0,03

234,97 ± 0,00

94,70 ± 0,01

540,96 ± 0,00

663,56 ± 0,01


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Silva Neto, P. J. da et ai, Sistema de produção de cacau para a Amazónia brasileira. Belém, CEPLAC, 2001
EFRAIM, Priscilla et al. Influência da fermentação e secagem de amêndoas de cacau no teor de compostos fenólicos e na aceitação sensorial. Ciênc. Tecnol. Aliment. [online]. 2010, vol.30, suppl.1, pp.142-150. ISSN 0101-2061.  http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20612010000500022.
LIMA, Milena Campelo Freitas de. Caracterização de substâncias fenólicas e alcaloides dos resíduos do cupuaçu (Theobroma grandiflorum (willd. Ex spreng.) Schum). 2013. 132f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do Amazonas, Manaus, 2013
CEPLAC. Comissão Executiva para o Plano da Lavoura Cacaueira. Programa de Recuperação da Lavoura Cacaueira – 3ª e 4ª etapas. A crise da lavoura cacaueira, condicionantes, ação governamental, análise e recomendações. Abril, 2009. Disponível em . Acesso em: 26 abr. 2016.
SANTOS, C.C (2013). Influência dos processos de fermentação e secagem no teor de compostos fenólicos e capacidade antioxidante de amêndoas de cacau amazônico (Theobromacacaovar. Forasteiro). (Dissertação de mestrado). Universidade Federal do Pará, Belém.
BRUNETTO , M. R .; GUTIÉRREZ , L .; DELGADO , Y .; Determinação Da Teobromina, Teofilina E Cafeína Em Amostras De Cacau por um método de cromatografia líquida de alto desempenho com a limpeza de amostra em linha num sistema de comutação de coluna, 2007.
PARECER DO ORIENTADOR: A aluna Rosiane Reis discente desenvolve suas atividades de maneira responsável e boa disponibilidade e busca para aprendizado de novos conhecimentos. Seu plano de trabalho está sendo executado dentro do cronograma inicialmente previsto.
DATA: __24__/_02_/_2017_

Prof. Jesus Nazareno Silva de Souza

ORIENTADOR







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